临八高校十设计实验.doc

十、细胞冻存时间对脾脏细胞活力的影响【实验目的】1. 细胞冻存时间对脾脏细胞新陈代谢的影响2. 学习细胞原代培养和传代培养的基本方法和主要操作步骤3. 了解体外培养细胞的液氮冻存与复苏技术实验原理】细胞冻存是细胞保存的主要方法之一利用冻存技术将细胞置于-196°C液氮 中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需 要的时候再复苏细胞用于实验而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在 培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用细胞 冻存时向培养基中加入保护剂一终浓度5%. 15%的甘油或二甲基亚W（DMSO）, 可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成, 从而避免细胞损伤采用''慢冻快融”的方法能较好地保证细胞存活标准冷冻 速度开始为T到-2°C / min,当温度低于-25°C时可加速，至l]-80°C之后可直接 投入液氮内（T96°C） oMTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法其检测原理为 活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶 甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砚（DMSO）能 溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值（0D值）， 可间接反映活细胞数量在一定细嗣数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正 比该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、 细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等它的特点是灵敏度高、经济实验材料】1. 器材：试管，吸管，培养瓶（灭菌），倒置显微镜，酒精灯，酒精棉球，试 管架，CO?细胞培养箱，超净工作台，镶子，注射器，离心机，巴氏管，血 球计数板，大头针，二氧化碳培养箱，眼科剪，眼科镶，培养皿，培养瓶， 离心管，吸管，酒精灯，培养基，盖玻片，滴管，显微镜，恒温水浴箱，冰 箱（4°C、-20°C, -70°C）,培养箱，液氮，冰箱，吸管（弯头、直头），废 液缸，移液管（10ml）,冻存管（l~2ml），微量加样枪，移液枪，酶联免疫 检测仪，摇床2. 试剂：PBS, 0. 25%胰蛋白酶，DMEM培养液，3%谷氨酰胺，小牛血清，7. 4%NaHC03,双抗溶液，0. 5%台盼兰染液，DTanks液，小牛血清，DMSO或 无色新鲜甘油，MTT（5mg/mL） □以上试剂均需分装，包扎好，灭菌后备用。

配置营养液DMEM液90%、小牛血清10%、双抗100单位/ml、3%谷氨酰胺 1ml、7.4% NaHCO3 调 pH 至 7.0-7.2【实验步骤】（1） 制备脾脏细胞，进行传代培养（2） 传代后的脾脏细胞分为两组：A组进行细胞冻存，冻存时间分别为：5h, 24h, 3d, 15d, 30dB组用MTT法测定细胞活性，并记录下细胞形态3） A组冻存的细胞经过复苏后分别用MTT法测定细胞活性，并记录下细胞形态与B组结果做比较，得到细胞冻存时间对脾脏细胞的影响1. 脾脏细胞的原代培养Cl）取材取小白鼠一只，采用断头法处死：清水洗小鼠并浸于75%酒精中灭菌3分钟取 出转入超净工作台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔取出脾脏，去除其周围的 脂肪组织，镶起脾脏用PBS液自上而下冲洗1—2次转入无菌玻璃培养皿C2）分离脾细胞用滴管先向上述无菌玻璃培养皿中滴入PBS液30滴，再用“L”型针头注射器在 皿中吸取PBS液0.2ml,然后将其沿脾长轴方向注射入脾内（使脾脏膨胀以利于 细胞散开）用针尖在脾脏上扎眼，并用“L”针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管吸皿中 的PBS液冲脾脏并吹散刮出的脾细胞，稍倾斜并静置1—2分钟。

吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入Eppendorf管，并使量至1ml,以 3000r/分离1—2分钟C3）培养脾细胞取上述离心后的Eppendorf管，在超净工作台内开盖弃去上清液，用“枪（200 U 1）”吸取塑料皿中的培养液400u 1加入弃去上清液的Eppendorf管中，用枪 头吹匀管底的脾细胞，然后吸取200u 1脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中， 混匀，然后放入37°C> 5%二氧化碳培养箱中培养2. 脾脏细胞的传代培养CD用75 %的酒精擦拭双手，取出待传代的细胞移去培养皿中的旧培养基， 加入5 mL PBS清洗残余的旧培养基，清洗两次，移去PBS2）补充营养液并以1： 2的比例分装C3）将分装好的细胞瓶做好标记，注明细胞代号、日期、置于培养架上，轻轻 摇动，以使细胞均匀分布，以免细胞堆积成团，然后置于含5 % C02, 37°C细胞 培养箱培养4）观察：细胞培养24h后，即可进行观察，主要观察：细胞是否被污染，主 要观察培养液颜色的变化及浑浊度•培养液正常情况下为桃红色；颜色变黄时，必须换液•真菌污染较为多见，大多形成白色或浅黄色小点浮于培养表面，肉眼可见； 有的散在生长，镜下观察呈丝状，管状，树枝状菌丝，此时，培养液透明。

•观察细胞是否生长，如细胞已生长，则要观察细胞的形态特征并判断其所处 的生长阶段对数生长期的细胞特点：细胞透明，颗粒少，细胞界限分明， 细胞核隐约可见细胞占瓶壁有效面积25%-75%以内，有新生细胞；75%-95% 时细胞排列紧密，有空隙；95%以上，细胞致密，透光性好3. 细胞冻存及复苏CD制备冻存液a. 配制含10%DMS0或甘油、10-20%小牛血清的冻存培液b. 取对数生长期的细胞，悬浮生长的脾脏细胞则直接将细胞移至15ml离心管中；c. 离心 1000r/min, 5min；d. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打 使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度5X107ml~lX 107ml；e. 将细胞分装入冻存管中，每管1〜1.5 ml；（2）冻存过程a. 先将冻存管放入4°C冰箱，约40minb, 接着置于-20°C冰箱，约30-60minoC. 置于-80°C超低温冰箱中放置过夜d. 置于液氮罐中长期保存e, 同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录3) 复苏过程a. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37°C温水中，并不时摇动令其尽快融化。

b. 从37°C水浴中取出冻存管，在超净台处打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加 到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；c. 离心 1000r/min, 5min；4. MTT法测定细胞活性CD接种细胞A. 离心细胞悬液，使细胞沉积下来用培养基重悬细胞，计数B. 将细胞稀释至2.5x103-50x103个/ml,每个微滴定板可容纳20ml细胞悬液C. 用加样器在平底96孔板中间十列的各孔中加入200口1细胞悬液，每孔加 0.5x103-10x103 个细胞D. 将200|jl培养基加至第1列和第12列的8个孔中第1列作读板议的空白 对照E. 将培养板放至塑料饭盒中，于37°C湿润环境中温育1-3天C2)待细胞到达对数期后，小心吸去上清液，加入90ul新鲜培养液，再加入 10ul MTT溶液，继续培养4 ho弃上清，每孔加入100ul二甲基亚砚，置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充 分溶解在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值3) 同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚飒)，对照孔(细胞、培养液、 MTT、二甲基亚飒)4) 将八个孔的吸光值平均，得到其吸光值5) A组的5个实验组与B组做比较，通过其0D值的大小来判断细胞的活性， 从而判定细胞新陈代谢的状态。

预期实验结果】预期结果A：细胞复苏后活性，随冻存时间延长，变化不明显预期结果B：细胞复苏后活性，随冻存时间延长，逐渐减弱【注意事项】1. 在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁为此，在操作前要认真地洗 手并用75%乙醇消毒操作前20〜30分钟起动超净台吹风2. 操作时，严禁说话，严禁用手直接拿无菌的物品，如瓶塞等，而要用器械， 如止血钳、镶子等去拿3. 冻存和复苏最好用新配制的培养液4. 使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用高压灭菌会 破坏其分子结构，以至于降低冷冻保护效果在常温下，DMSO对人体有害， 故在配制时最好戴上手套操作5. 冻存液的问题：二甲基亚砚(DMSO)对细胞不是完全无毒副作用，在常温下, 二甲基亚飒对细胞的毒副作较大，因此，必须在l-2min内使冻存液完全融 化如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤6. 离心前须加入较多培养液细胞解冻后二甲基亚砚浓度较高，加入培养液可 稀释其浓度，以减少对细胞的损伤7. 不宜将冻存细胞放置在0°C—60°C这一温度范围内过久，低温损伤主要发生 在这一温度区内，是“危险温区”。