直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价指南.pdf

直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价指南1 适用范围1. 1 本指南规定了直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价的基本原则、基本要求、评价方法以及结果判定1. 2 本指南适用于新饲料添加剂评审和已经批准使用的饲料添加剂再评价时,对直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株开展的鉴定及其安全性评价,包括发酵制品中与生产菌株直接相关的安全性评价1. 3 本指南仅涵盖直接饲喂微生物和发酵制品与生产菌株相关的鉴定及其安全性评价,产品的其他安全性评价按照相关规定和指南开展1. 4 本指南所称微生物包括细菌、酵母和丝状真菌 其他如古菌、微藻等微生物的相关评价可参照本指南要求,采取个案分析评价1. 5 本指南适用于通过农业转基因生物安全评价、获得农业转基因生物安全证书的转基因微生物生产菌株及其发酵制品的相关内容评价1. 6 饲料或饲料原料发酵生产所用微生物菌株的鉴定及其安全性相关内容评价参照本指南进行22 术语和定义以下术语和定义适用于本指南2. 1 直接饲喂微生物(Direct-Fed microorganisms)在饲料中添加或直接饲喂给动物的活的微生物饲料添加剂2. 2 发酵制品(Fermentation products)微生物在受控制条件下,通过生命活动生产的特定代谢产物经分离、提取、纯化、精制和干燥等工艺制成的饲料添加剂,如氨基酸、维生素、酶制剂等。

2. 3 抗微生物药物(Antimicrobial)合成或天然存在的能杀死微生物或抑制其在动物或人体内生长或繁殖的活性物质,在本指南中特指抗菌药物注:本指南中抗菌药物包括用于人体或动物的世界卫生组织(WHO) 定义的极为重要抗菌药物(CIAs) 或高度重要抗菌药物(HIAs)2. 4 获得性耐药(Acquired antimicrobial resistance)在对特定抗菌药物典型敏感的菌种中,由于获取外源基因或基因突变引起某一菌株对该抗菌药物产生的耐药2. 5 关注基因(Gene of concern)已知毒力因子的编码基因、耐药基因,以及与已知毒性化合物产生等有关的基因2. 6 临界值(Cut-off value)根据抗菌药物对特定微生物类群(种或属)的最低抑菌浓度3(MIC)分布而设定的,用于耐药判定的值2. 7 转基因微生物(Genetically modified microorganisms)利用基因工程技术改变基因组构成的重组微生物2. 8 危害(Hazard)饲料中对人和动物健康有潜在不良影响的生物、化学或物理性因素或条件2. 9 风险(Risk)饲料中危害产生某种不良健康影响的可能性或严重性。

2. 10 产毒能力(Toxigenicity)微生物产生对人和动物有毒作用的活性代谢产物的能力2. 11 致病性(Pathogenicity)微生物感染宿主造成健康损害引起疾病的能力2. 12 毒性(Toxicity)微生物有毒代谢产物引起的宿主健康损伤3 基本原则3. 1 直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价应基于当前的科学认知开展,具体的评价试验应遵循本指南规定的一般原则,并结合直接饲喂微生物和发酵制品特征属性进行方案设计和试验实施3. 2 直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价试验应按照国家、行业标准或参照国际组织标准检测方法、技术规范等进行,若无相关标准检测方法、技术规范则按照行业公认的4检测方法进行3. 3 直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价试验(包括检测)应由具备微生物相关专业知识和试验技能的专业人员在具备相应设施设备的试验场所,按照规范的操作程序进行 试验应在有效的质量控制下开展,并且由试验机构指定的负责人负责 用于新饲料添加剂申报的,微生物鉴定及其安全性评价试验应由农业农村部指定的评价试验机构开展 农业农村部尚未指定评价试验机构的,应由具有相应条件和能力的检测评价机构开展。

3. 4 直接饲喂微生物或发酵制品生产中使用复合菌株时,应分别针对每个菌株开展相关评价3. 5 本指南中涉及的用于菌株安全性分析、比对、评价的相关数据库、药物名单等,应采用最新版本3. 6 鉴于菌株在使用过程中可能产生变异或衰退,开展安全性评价时应充分考虑菌株鉴定报告及安全性评价相关检测报告的时效性4 基本要求通过形态观察、生理生化检测和分子生物学分析等技术方法对直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株进行鉴定 通过表型试验、分子生物学试验、全基因组序列(WGS)分析、相关文献资料综述等,对微生物产毒能力和致病性、抗菌药物敏感性、抗菌药物产生等特性进行评价,对直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株安全5性进行综合评估 不同微生物及生产菌株评价基本要求见表 1表 1菌株鉴定及其安全性评价基本要求评价内容章节直接饲喂微生物发酵制品生产菌株细菌酵母和丝状真菌细菌酵母和丝状真菌微生物鉴定5. 1产毒能力和致病性5. 3抗菌药物敏感性5. 4抗菌药物产生5. 5生产菌株的遗传修饰5. 6仅适用于转基因微生物仅适用于转基因微生物发酵制品中无生产菌株活细胞评价5. 7发酵制品中生产菌株DNA 检测5. 8必要时必要时5 评价方法5. 1 微生物鉴定5. 1. 1 基本信息明确直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株的来源、属名、种名(包括中文学名、拉丁学名等)和菌株名称或编号。

细菌的命名应遵循原核生物系统学国际委员会(ICSP)的规定,并符合原核生物国际命名法规(ICNP)要求 酵母和丝状真菌的命名应符合国际藻类、真菌和植物命名法规(ICN)的要求 明确菌株的改良史,包括实施的诱变步骤和遗传修饰 转基因生产菌株的遗传修饰按照5. 6 的要求进行描述65. 1. 2 鉴定直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株应明确鉴定至少到种或亚种水平 若根据最新方法和当前知识菌株无法明确鉴定至已有物种,应进行菌株及其近缘种的系统发育分析5. 1. 2. 1 细菌鉴定综合形态观察、生理生化检测、分子生物学分析对细菌进行鉴定 形态观察:包括菌落颜色、形状、边缘、透明度等宏观形态观察,以及菌体大小、形状、革兰氏染色反应、是否有芽胞、芽胞的着生位置等微观形态观察 生理生化检测:包括碳源利用、氮源利用、氧化酶反应、过氧化氢酶反应等关键生理生化特征检测 分子生物学分析:如 16S rDNA 序列、持家基因序列或WGS 等分析 用于新饲料添加剂申报的,应利用 WGS 数据进行分析鉴定5. 1. 2. 2 酵母菌鉴定综合形态观察、生理生化检测、分子生物学分析对酵母菌进行鉴定 形态观察:包括菌落质地、颜色、边缘等宏观形态观察,以及菌体大小、形状、是否有真假菌丝、生殖方式等微观形态观察。

生理生化检测:包括碳源利用、糖类发酵、氮源利用等关7键生理生化特征检测 分子生物学分析:如 26S rDNA、ITS rDNA 等特征序列或WGS 分析5. 1. 2. 3 丝状真菌鉴定综合形态观察、分子生物学分析对丝状真菌进行鉴定 形态观察:包括菌落的质地、颜色、生长速度、色素的产生等宏观形态观察,以及菌丝的颜色、产孢结构的大小及发生方式、孢子颜色、形状、是否具有有性生殖结构等微观形态观察 分子生物学分析:如 18S rDNA 序列、ITS rDNA 序列及其他特征基因(如微管蛋白基因、钙调蛋白基因、翻译延伸因子等)序列或 WGS 分析5. 2 WGS 测序采用二代和三代测序技术对直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株进行全基因组测序,获得其基因组完成图,测序报告至少应包括以下信息:DNA 提取方法;测序方案和仪器;序列组装方法,如生物信息学方法、从头测序或重测序等;序列质量评价,如平均 Phred 得分、reads 数目、覆盖度、N50 和 K-mer 等;WGS 的 FASTA 电子文件;相对于预期基因组大小的 contigs 总长度;基因注释方法;对于酵母和丝状真菌,还需提供从相关数据库(如 BUSCO 数据库)获得的注释质量信息。

85. 3 产毒能力和致病性应通过国内外安全性评价资料综述、动物致病性试验和 WGS分析对直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株的产毒能力和致病性进行综合评价,其中丝状真菌还应开展产毒试验鉴于屎肠球菌(Enterococcus faecium)和芽胞杆菌(Bacillus spp. )已有成熟的致病性评价方法,可分别按附录 A 和附录 B 开展评价5. 3. 1 国内外文献资料综述通过国内外文献数据检索(具体要求见附录 C),收集整理菌株的国内外使用历史、安全性评价资料,包括对人和靶动物的产毒能力和致病性的相关信息;若无该评价菌株的上述资料,应收集整理同种内其他菌株或与其相近种属的相关信息 若对菌株进行了任何降低毒性和致病性的选育(包括诱变和/ 或遗传修饰),应予以说明5. 3. 2 动物致病性试验制备直接饲喂微生物或发酵制品生产菌株的菌悬液,将其作为受试物,通过腹腔注射和经口灌胃等途径给予实验动物,评价不同暴露途径下受试物对实验动物的致病性 动物致病性试验按照国家、行业标准方法开展5. 3. 3 WGS 分析5. 3. 3. 1 细菌将菌株 WGS 与最新数据库(包括但不限于 VFDB、PAI DB、9CGE 等)中存储的序列进行比对,分析菌株遗传物质中是否存在已知毒力因子的编码基因。

分析结果重点关注该种或近缘种中已知毒力因子(如毒素、入侵与粘附因子)的完整编码基因 结果至少应包括如下信息:基因名称、定位(染色体或质粒)、编码蛋白的功能、覆盖度(序列长度覆盖度70% )、相似性百分比(输入序列与数据库中序列的匹配度80% )和 e 值(临界值时,认为菌株对该抗菌药物耐药对于附录 D 中未列出的细菌,测定的 MIC 值应与该种或相关种的已发表文献值进行比较5. 4. 2 WGS 耐药基因分析对菌株 WGS 进行分析,检测对用于人或动物的抗菌药物(WHO 发布的 CIAs 或 HIAs)耐药的编码基因或起促进作用的基因 对菌株 WGS 进行分析时,应将其与最新耐药基因分析数据库21进行比对,如 CARD 和 ResFinder 等 分析结果重点关注抗菌药物耐药性完整编码基因,至少应包括如下信息:基因名称、定位(染色体或质粒)、编码蛋白的功能、覆盖度(序列长度覆盖度70% )、相似性百分比(输入序列与数据库中序列的匹配度80% )和 e 值(临界值(附录 D),若通过 WGS 分析未发现与选定抗菌药物表型相关的已知耐药基因,则认为菌株不具有获得性耐药;若通过 WGS 分析检测到与抗菌药物表型直接相关的已知耐药基因,则认为菌株具有获得性耐药。

5. 4. 3. 3 对所有菌株,若通过 WGS 分析,发现存在除附录 D 中选定抗菌药物以外的其他 CIAs 或 HIAs 的耐药基因,则应分别测定对应抗菌药物的 MIC 值,并与文献值进行比较: 当 MIC 值文献值,应评估耐药基因变为活性基因的可能性(如与活性基因序列进行比较等),并进行综合判断菌株是否具有获得性耐药;31 当 MIC 值文献值,则认为菌株具有获得性耐药5. 5 抗菌药物产生应对直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株是否产生人或动物用抗菌药物(WHO 发布的 CIAs 或 HIAs)进行评价,已知不产生人或动物用抗菌药物的微生物菌种除外 产品生产过程中若使用任何抗菌药物,应予以说明应评价培养物上清液对抗菌药物敏感的参考菌株的抑菌活性 推荐 EUCAST、CLSI 等相关方法中的参考菌株,也可使用国家级菌种保藏中心的等效菌株,也可根据实际生产情况增加参考菌株 若检测结果显示拟评价菌株培养物上清液对一种或一种以上参考菌株出现抑菌活性,应对抑菌物质进行鉴定,确定其是否为人或动物用抗菌药物若用于发酵制品的生产菌株能产生人或动物用抗菌药物,应证明发酵制品中无抗菌药物残留 应明确说明用于抗菌药物残留检测样品的具体采样阶段。

样品应来自工业化生产线,若尚无工业化产品,可采用中试产品5. 6 生产菌株的遗传修饰若发酵制。