基因工程目的基因的获取课件.pptx

第五章第五章 目的基因的获取目的基因的获取目的基因：目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的基因准备要分离、改造、扩增或表达的基因需要克隆的需要克隆的DNADNA片段片段编码某种蛋白质编码某种蛋白质研究某基因结构研究某基因结构和功能的关系和功能的关系研究某基因与研究某基因与疾病的关系疾病的关系目的基因的获取目的基因的获取化学合成法化学合成法基因组基因组DNADNA文库文库;cDNA;cDNA文文库库聚合酶链式反应聚合酶链式反应直接从染色体直接从染色体DNA中分离中分离第一节第一节 基因组基因组DNA片段化片段化一、限制性内切酶法一、限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组用限制性内切酶把基因组DNA切成不同切成不同大小的片断大小的片断酶切酶切由于带有粘性末端，产物可以直接与载由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接1. 优点优点2. 缺点缺点目的基因目的基因内部内部也可能有该内切酶的切点也可能有该内切酶的切点目的基因也被切成碎片！目的基因也被切成碎片！BamH IBamH IBamH Igene二、随机片断化二、随机片断化1. 限制性内切酶局部消化法限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和消化时间，使基控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。

切开 内切酶识别位点的碱基数内切酶识别位点的碱基数影响所切出的产物的长度和随机程度影响所切出的产物的长度和随机程度1）限制性内切酶的选用原则）限制性内切酶的选用原则1）4bp的内切酶的内切酶平均每平均每46（4096）bp一个切点一个切点2）6bp的内切酶的内切酶平均每平均每44（256）bp一个切点一个切点随机程度高如随机程度高如Hae、AluI、Sau3A 内切酶粘性末端内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连能与常用克隆位点相连Sau3ABamH I）2. 机械切割法机械切割法（1）超声波）超声波超声波强烈作用于超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约，可使其断裂成约300bp的随机片断的随机片断2）高速搅拌）高速搅拌1500转转/分下搅拌分下搅拌30min，可产生约，可产生约8kb的随机片断的随机片断3）DNA溶液小孔喷射溶液小孔喷射注射器法可将注射器法可将100kb以上的以上的DNA剪切成剪切成10 kb左右左右的片段1976年年H.G. Khorana提出了用化学方法提出了用化学方法合成基因的设想，并于合成基因的设想，并于1979年在年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸酸tRNA基因的论文。

基因的论文第二节第二节 化学合成目的基因化学合成目的基因要求：要求：1、已知目的基因的核苷酸序列、已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列或其产物的氨基酸序列 2、分子量较小的目的基因的制备分子量较小的目的基因的制备 由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列* 化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因一、目前常用的方法一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸二酯法、亚磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法固相合成法自动化合成法自动化合成法磷酸三酯法、磷酸三酯法、 保护保护dNTP的的5端端P 或或3端端-OH 用酸或碱的脱保护用酸或碱的脱保护（1）原理）原理1. 磷酸二酯法磷酸二酯法 带保护的单核苷酸连接带保护的单核苷酸连接保证合成反应的定向进行保证合成反应的定向进行带带5保护的单核苷酸与带保护的单核苷酸与带3保护的另一保护的另一个单核苷酸以个单核苷酸以磷酸二酯键磷酸二酯键连接起来连接起来2）合成过程）合成过程下一个下一个5端保护的单核苷酸又可以同端保护的单核苷酸又可以同3端保护的端保护的二核苷酸聚合二核苷酸聚合原理是将所要合成的寡聚核苷酸链的原理是将所要合成的寡聚核苷酸链的3-末端先以末端先以3-OH与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠（与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠（CPG）连）连接，然后依次从接，然后依次从3-5的方向将核苷酸单体加上去，的方向将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，具体的合成和延伸过程如图。

具体的合成和延伸过程如图2.亚磷酸三酯法亚磷酸三酯法 化学合成的化学合成的DNA片断一般在片断一般在200bp以内二、二、 化学合成化学合成DNA片断的组装片断的组装 用用T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶使各个片段的使各个片段的5端带端带上磷酸1. 互补连接法互补连接法 预先设计合成的片断之间都有预先设计合成的片断之间都有互补区互补区域域，不同片断之间的互补区域能形成有，不同片断之间的互补区域能形成有断断点点的完整双链的完整双链2 2）5端磷酸化端磷酸化（1 1）互补配对）互补配对（合成的（合成的DNADNA单链的单链的5 5端是端是-OH-OH）T4 DNA连接酶连接酶T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶使使5-OH磷酸化磷酸化完整的完整的DNA双链双链（3 3）连接酶连成完整双链连接酶连成完整双链2. 互补延伸连接法互补延伸连接法预先设计的片断之间有预先设计的片断之间有局部互补区局部互补区，可以，可以相互作为另一个片断延长的引物，用相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶聚合酶延伸成完整的双链延伸成完整的双链355353T4DNA连接酶连接酶Klenow片段片段引物引物1. 直接合成基因直接合成基因三、三、 寡聚核苷酸化学合成的优点寡聚核苷酸化学合成的优点2. 合成引物（合成引物（20mer左右）左右）（1 1）mRNA的含量很低，很难作的含量很低，很难作cDNA3. 合成探针序列合成探针序列4. 定点突变合成定点突变合成合成带有合成带有定点突变定点突变的基因片断。

的基因片断2）有些基因比较短，化学合成费用较低）有些基因比较短，化学合成费用较低DNA合成仪合成仪5. 合成人工接头或衔接物合成人工接头或衔接物含有各种酶切位点含有各种酶切位点人工接头人工接头（Adaptor）或）或衔接物衔接物（Linker）序列EcoRIEcoRILinkerAdaptor第三节第三节 PCR扩增获得目的基因扩增获得目的基因以前讲过关于PCR相关的知识，在这里不在累述PCR 可以把可以把 指定的基因片段指定的基因片段 数数量放大量放大染色体PCR 基因放大基因放大连琐连琐反反应应聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)(polymerase chain reaction, PCR)第四节第四节 从基因文库、从基因文库、cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因一、基因文库的构建一、基因文库的构建1. 基因文库（基因文库（gene library） 将某种生物细胞的将某种生物细胞的整个基因组整个基因组DNA切割切割成大小合适的片断，并将成大小合适的片断，并将所有这些片断所有这些片断都与都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保保存和扩增存和扩增。

理论上讲，这些重组载体上带有理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的了该生物体的全部基因全部基因，因此，称之为基因，因此，称之为基因组文库（组文库（genomic library）或基因文库（）或基因文库（gene library）组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库存在于转化细胞内由克存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基隆载体所携带的所有基因组因组DNA的集合的集合* 从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因（2 2）目前常用的载体目前常用的载体 2. 构建基因文库的载体选用构建基因文库的载体选用载体能够容载的载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的建完整的基因文库所需要的重组子重组子的数目载体容量越大，所要求的载体容量越大，所要求的DNA片断数目片断数目越少，所需的越少，所需的重组子重组子越少1 1）对载体的要求）对载体的要求 载体系列：载体系列： 容量为容量为 24 kpcosmid载体：载体： 容量为容量为 50 kb YAC： 容量为容量为 1 MbBAC: 容量为容量为 300 kb断点完全随机，片断长度合适于载体连接。

断点完全随机，片断长度合适于载体连接不能用一般的限制性内切酶消化法不能用一般的限制性内切酶消化法1）染色体）染色体DNA大片段的制备大片段的制备3. 基因文库构建的一般步骤基因文库构建的一般步骤超声波（超声波（300bp）或机械搅拌（）或机械搅拌（8kb） 物理切割法：物理切割法：内切酶内切酶Sau3A进行局部消化可得到进行局部消化可得到10-30kb的随机片断的随机片断 酶切法：酶切法：（2）载体与基因组）载体与基因组DNA大片段的连接大片段的连接 粘性末端直接连接粘性末端直接连接直接连接、人工接头或同聚物加尾直接连接、人工接头或同聚物加尾人工接头法人工接头法（adapter）同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接 平端连接平端连接同聚物加尾连接同聚物加尾连接Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用目的基因用 Bam H切割切割载体载体DNA用用Bam H切割切割重组体重组体载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同同一一限限制制酶酶切切位位点点连连接接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接Eco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点+ +EcoR+ Bg l双酶切双酶切Eco R+ Bg l双酶切双酶切T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。

接相似目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连5335载体载体DNA5335目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3 35 5 3 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+ dATP末端转移酶末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体人人工工接接头头及及其其应应用用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R4. 基因组文库的大小基因组文库的大小一个文库要包含一个文库要包含99%的基因组的基因组DNA时所需要的克隆数目时所需要的克隆数目N=ln (1-p)ln (1-f)p: 文库包含了整个基因组文库包含了整个基因组DNA的概率（的概率（99%）f: 插入载体的插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因组片断的平均长度占整个基因组DNA的的百分数百分数N：所需的重组载体数（克隆数：所需的重组载体数（克隆数）例如：从人基因组例如：从人基因组DNA（总长度为（总长度为3109bp）的文库中筛选到长约）的文库中筛选到长约1.5kb目的基因的可能性为目的基因的可能性为99，那么这个基因组文库要多大？，那么这个基因组文库要多大？ ln（10.99） N = = 9.2106 ln （11.51033109）若用质粒（若用质粒（若用质粒（若用质粒（pBR322pBR322）克隆目的基因（）克隆目的基因（）克。