忍冬藤饮片标准煎液质量评价研究.docx

    忍冬藤饮片标准煎液质量评价研究    范帅帅　田伟　王相　冯玉　李军山　牛丽颖Summary：目的 制备忍冬藤饮片标准煎液，并建立其质量控制方法方法 按照标准煎液制备要求制备15批忍冬藤饮片标准煎液，以绿原酸、咖啡酸、马钱苷作为定量检测指标，计算出膏率、含量和转移率，并建立超高液相色谱特征图谱分析方法结果 15批忍冬藤饮片标准煎液的出膏率范围为6.44%～11.95%，绿原酸、咖啡酸、马钱苷含量范围分别为12.17～22.61 mg/g、2.75～5.12 mg/g、21.71～40.32 mg/g，转移率范围分别为28.13%～52.25%、53.93%～100.15%、40.04%～74.36%采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》软件进行分析和相似度评价，标定了10个共有特征峰，并指认绿原酸、咖啡酸、马钱苷3个色谱峰通过与对照图谱比对，相似度均高于0.96结论 本研究建立的忍冬藤饮片标准煎液的质量评价方法准确、稳定、重复性良好，可为忍冬藤配方颗粒的质量控制提供参考Key：忍冬藤；饮片；标准煎液；配方颗粒；转移率；出膏率；含量测定；特征图谱：R284.1 ：A ：1005-5304（2019）03-0082-06Abstract： Objective To prepare standard decoction of Lonicerae Japonicae Caulis decoction pieces； To establish quality control method. Methods Fifteen batches of standard decoction of Lonicerae Japonicae Caulis decoction pieces were prepared according to the standardization method. With chlorogenic acid， caffeic acid and loganin as the detection indices， the extraction rate， content， and transfer rate were calculated and the UPLC characteristic chromatograms analysis method was established. Results According to the measurement of 15 batches of standard decoction of Lonicerae Japonicae Caulis decoction pieces， the extractum rate was at the range of 6.44%–11.95%. The contents of chlorogenic acid， caffeic acid and loganin were 12.17–22.61 mg/g， 2.75–5.12 mg/g and 21.71–40.32 mg/g， respectively. The transfer rates were 28.13%–52.25%， 53.93%–100.15% and 40.04%–74.36%， respectively. Besides， Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM （2012 edition） was used to analyze and compare the characteristic chromatograms. Ten common peaks were determined， and three chromatographic peaks of chlorogenic acid， caffeic acid， and loganin were identified. The similarity was over 0.96 by comparing with the control map. Conclusion This study establishes the quality control method of standard decoction of Lonicerae Japonicae Caulis decoction pieces， which is accurate， stable， and with good repeatability， which can provide references for the quality control of Lonicerae Japonicae Caulis formula granules.Keywords： Lonicerae Japonicae Caulis； decoction pieces； standard decoction； formula granules； transfer rate； extractum rate； content determination； characteristic chromatogram忍冬藤為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥茎枝[1]。

始载于陶弘景《名医别录》：“今处处皆有，似藤生，凌冬不凋，故名忍冬忍冬藤有清热解毒、疏风通络的功效忍冬藤在我国大部分地区有分布，很多地方已有栽培，其中以河南、山东的产量最大研究表明，忍冬藤主要活性成分为有机酸类和环烯醚萜苷类[2-3]绿原酸和咖啡酸具有一定的抗菌、抗感染作用[4]，在忍冬藤中含量较高，为其主要活性成分[5]；马钱苷具有抗炎及调节免疫功能的作用[5]三者的药理活性能够体现忍冬藤的功效因此，以绿原酸、咖啡酸、马钱苷为指标成分测定其含量，能更好地整体评价忍冬藤的内在质量标准煎液的制备遵循传统煎液的煎煮原则，对工艺流程要求规范化和标准化，保证临床用药的准确性[6]因此，本研究以水为溶媒，采用煎煮方式制备15批忍冬藤饮片标准煎液，对忍冬藤有效成分进行提取，通过测定绿原酸、咖啡酸、马钱苷3个主要活性成分的含量、转移率和出膏率的范围，并以特征图谱为主的整体质量控制方法建立15批忍冬藤标准煎液的UPLC特征图谱，评价忍冬藤标准煎液的内在质量，为忍冬藤配方颗粒的质量控制和源于忍冬藤水煎液的制剂质量控制提供数据参考1 仪器与试药ACQUITY UPLC H-Class系统（PDA检测器），美国沃特世公司；Empower3色譜工作站，美国沃特世公司；LC-15C高效液相色谱仪（SPD-15C型紫外检测器、SIL-10AF自动进样器、CTO-15C柱温箱），日本岛津公司；Pilot5-8L真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；TB-215D、BSA224S-CW电子分析天平，北京赛多利斯；JY10001型电子天平，上海民桥精密科学仪器有限公司；KQ-250型超声波清洗器（功率250 W，频率40 kHz），昆山市超声仪器有限公司；RE-3000型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；BJH-W200F型陶瓷自动中药煲（电源220 V、50 Hz，功率300 W，容量2.0 L），广东天际电器股份有限公司；DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司。

绿原酸对照品（批号PY20170216，纯度≥99%），南京普怡生物科技有限公司；咖啡酸对照品（批号110885-200102，纯度≥99%），中国食品药品检定研究院；马钱苷对照品（批号MUST-16080704，纯度≥98%），成都曼思特生物科技有限公司；乙腈（Fisher化学试剂公司）、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯15批不同产地忍冬藤饮片均由神威药业集团有限公司提供，经河北省药品检验院孙宝惠主任药师鉴定为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥茎枝，样品来源见表12 方法与结果2.1 标准煎液的制备取忍冬藤饮片100 g，使用煎药壶煎煮2次一煎加水10倍，浸泡30 min，武火煮沸，文火保持微沸20 min；二煎加水8倍，武火沸腾，文火保持微沸15 min趁热用200目筛网分离煎液，煎液迅速放入冷水浴中冷却，合并2次煎液60 ℃真空减压浓缩至密度为1.00～1.02 g/mL，使用密度计和pH计测定流浸膏的密度和pH值，放入冰柜冷冻（-40 ℃）过夜，用冷冻干燥机干燥，得标准煎液干膏粉，计算出膏率出膏率（%）=冻干粉质量÷饮片质量×100%，按2015年版《中华人民共和国药典》（四部）通则0800水分测定法第二法（烘干法）测定水分。

结果见表2以均值上下浮动30%来规定出膏率，15批忍冬藤饮片标准煎液出膏率为6.44%～11.95%2.2 绿原酸、咖啡酸和马钱苷含量测定2.2.1 色谱条件色谱柱：Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流动相A为0.3%磷酸，流动相B为乙腈，梯度洗脱（0～30 min，7%B；30～32 min，7%→10%B；32～50 min，10%B；50～51 min，10%→90%B；51～57 min，90%B；57～58 min，90%→7%B；58～65 min，7%B）；流速：1.0 mL/min；检测波长：马钱苷236 nm，绿原酸、咖啡酸327 nm；进样量：5 ?L；柱温：35 ℃色谱图见图12.2.2 对照品溶液的制备取绿原酸、咖啡酸、马钱苷对照品适量，精密称定，加甲醇配制成每1 mL含34.6 ?g绿原酸、6.1 ?g咖啡酸和67.9 ?g马钱苷的混合对照品溶液，即得2.2.3 供试品溶液的制备取本品干膏粉适量，研细，取约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率35 kHz）10 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，即得忍冬藤标准煎液供试品溶液；取15批饮片粉末各约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率35 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，即得忍冬藤饮片供试品溶液。

2.2.4 方法学考察2.2.4.1 线性关系考察精密吸取对照品溶液4、6、8、10、12、14 ?L，按上述色谱条件测定，以绿原酸进样量为横坐标，测定的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明绿原酸在0.138～0.484 ?g范围内线性关系良好，回归方程为：Y=1.991×106X+3.348×104，r=0.999 8；以咖啡酸进样量为横坐标，测定的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明咖啡酸在0.024～0.085 ?g范围内线性关系良好，回归方程为：Y=4.400×106X+1.419×104，r=0.999 7；以马钱苷进样量为横坐标，测定的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明马钱苷在0.271～0.950 ?g范围内线性关系良好，回归方程为：Y=1.433×106X+5.419×104，r=0.999 62.2.4.2 精密度试验精密吸取对照品溶液5 ?L，按上述色谱条件连续进样6次，绿原酸、咖啡酸、马钱苷峰面积的RSD分别为1.04%、1.52%、1.19%，均小于2%，表明仪器精密度良好2.2.4.3 稳定性试验精密称取标准煎液干膏粉约0.1 g，按供试品溶液制备方法制备。

精密吸取供试品溶液5 ?L，按上述色谱条件分别于0、2、4、6、8、10 h进样测定，绿原酸、咖啡酸、马钱苷峰面积RSD。