噬菌体（96页）.ppt

Bacteriophage 噬菌体概述1 噬菌体展示技术2 3 噬菌体载体4 细菌的检测与治疗 5 噬菌体转导 第一章 噬菌体概述 分类 简史 概念 结构 特性 1 1噬菌体概念 噬菌体是感染细菌 真菌 放线菌 螺旋体等微生物的 病毒 只能在活的微生物细 胞中复制增殖 1 1噬菌体概念 噬菌体 分裂中的大肠杆菌 大肠杆菌 电镜扫描图 附在细菌上的噬菌体 噬菌体 1 2 噬菌体发展简史 u1896年 英国细菌学家Hankin发现了水中 存在抗细菌现象 并认为有种不明物质引 起了这种现象 u1915年 英国Twort在葡萄球菌中发 现噬菌体 u1917年 加拿大人F d Herelle在法国巴 斯德研究所又独立发现痢疾杆菌噬菌体 1 2 噬菌体发展简史 现象 本来混浊的菌悬液经一夜振荡培养后 反而变清 为了弄清原因 他把变清的培 养液用细菌过滤器过滤 并把滤液滴在痢 疾杆菌菌液里 奇怪的现象再次发生 他 还建立了空斑滴定法 此法简单 方便准 确 至今仍是定量测定噬菌体浓度的有效 手段 而且为动物病毒定量滴定所借鉴 建立了病毒空斑滴定法 1 3 噬菌体的特性 1 2 3 个体微小 可通过细菌滤器 无细胞结构专性细胞内寄生 分布广泛 1 3 噬菌体的特性 裂解或不裂解细菌 4 5 6 有抗原性可刺激机体产生抗体 能够抵抗热 低温 冰冻等 1 4 噬菌体结构 1 5 噬菌体的化学组成 核酸 头部核心 DNA或RNA 作用 噬菌体的遗传物质 蛋白质 头部外壳和尾部 作用 保护核酸 构成外壳和尾部 1 5噬菌体的化学组成 噬菌体的一些结构蛋白 1 6 噬菌体的分类 u按照基本形态可划分为三类 蝌蚪状 T4 微球状 x174 和丝状 M13 根据噬菌体结构的不同可将其分为 1 23 无尾部结 构的二十 面体 有尾部结 构的二十 面体 线状体 1 6 噬菌体的分类 迄今已知的噬菌体大多 数是有尾部结 构的二十面体 到目前为止 研究者至少 对5568种噬菌体进行了电镜观察 绝大多 数 占96 2 为有尾噬菌体 1 6 噬菌体分类 u按遗传物质类型进行划分 线状双链DNA 多数 1 DNA噬菌体 环状单链DNA 少数 线状单链RNA 多数 2 RNA噬菌体 线状双链RNA 少数 1 6 噬菌体分类 1 6 噬菌体分类 u根据噬菌体与宿主的关系 1 烈性噬菌体 指感染宿主细胞后 能 够使宿主细胞裂解的噬菌体 2 温和噬菌体 噬菌体感染细胞后 将其 核酸整合到宿主的核DNA上 并且可以随宿 主DNA的复制而进行同步复制 在一般情况 下 不引起寄主细胞裂解的噬菌体 1 7 噬菌体侵染细菌实验 u烈性噬菌体侵染细菌的过程 1 吸附 2 注入 3 增殖 4 装配 5 裂解 1 7 噬菌体侵染细菌实验 1 7 噬菌体侵染细菌实验 u噬菌体的侵染实验的结果 证明了DNA是遗传物质 1 7 温和噬菌体与菌细胞的作用 溶菌周期 溶原周期 第二章 噬菌体展示技术 1985年 Smith第一次 成功地将EcoRI核酸内 切酶基因插入丝状噬菌 体基因p 中 并在噬菌 体表面表达出了融合的 蛋白 2 噬菌体展示技术 噬菌体 Company Logo 噬菌体展示技 术 2 1 噬菌体展示技术的发展 1988 噬菌质粒系统 1990 抗体片段的展示 1993 展示cDNA文库 1994 研发了 phage two hybrid 技术 1996 首次体内in vivo 淘选试验 1998 噬菌体展示载体作为基因导入载体 1999 Combination of phage display with high density arrays 2001 Automated phage display selection 2 2 噬菌体展示技术的原理 以噬菌体或噬菌粒为载体 将目标蛋白 的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因 的适当位置 使外源蛋白随噬菌体的重新 组装而展示到噬菌体表面 通过筛选表达 有特异肽或蛋白质的噬菌体 并得到大量 富集 从而获得目的多肽或蛋白质 Company Logo LeadHvLinkLvEPIII PIII 基因型表达型 融合蛋白 2 3 噬菌体展示技术流程 Company Logo 2 4 常用的噬菌体展示系统 常用的噬菌体展示系统 M13丝 状 噬菌体 T7噬菌体T7噬菌体 噬菌 体 T4噬菌 体 T4噬菌 体 2 5 噬菌体展示技术的优点 非展示系统 展示系统 2 5 噬菌体展示技术的优点 特定分子的基因型和其表型统一在同一个 病毒颗粒内 将重组蛋白质筛选与基因筛 选合二为一 被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的 空间结构和生物活性 以利于靶分子的识 别和结合 由于丝状噬菌体易于在大肠杆菌系统中分 离扩增 因此此技术又合并了选择能力和 扩增能力的优势 使得噬菌体展示技术成 为高效的筛选体系 操作简单易行 该技术采用经典的PCR分子 克隆等技术即可操作 在几周内即可筛选 106 108克隆 筛选获得抗体库可以用于原 核系统表达 无需组织培养 极大地降低 了成本 筛选获得噬菌体随机肽库具有容量大 体 积小 筛选简便 制备成本低 可多次扩 增等突出优点 2 6 噬菌体展示技术的局限性 所建库的容量和分子多样性受到限制 不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的 表达 噬菌体展示文库一旦建成 很难再进行有效 的体外突变和重组 进而限制了文库中分子 遗传的多样性 由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表 达 所以 一些对细胞有毒性的分子如生物 毒素分子 很难得到有效表达和展示 2 7 噬菌体抗体库技术 它是在它是在PCRPCR技术和技术和Phage DisplayPhage Display的基的基 础上实现的 把用础上实现的 把用PCRPCR法得到的抗体基因插法得到的抗体基因插 入丝状噬菌体的入丝状噬菌体的DNADNA 在辅助噬菌体的帮助 在辅助噬菌体的帮助 下 噬菌粒包装成丝状噬菌体 抗体分子下 噬菌粒包装成丝状噬菌体 抗体分子 通过与通过与P P 或或P P 相连 在噬菌体表面的一相连 在噬菌体表面的一 端或分散分布 然后可直接对噬菌体表面端或分散分布 然后可直接对噬菌体表面 的抗体分子进行筛选 的抗体分子进行筛选 2 7 噬菌体抗体库的分类 1 根据 免疫抗体库 插入基 因片段 非免疫抗体库 天然抗体库 的来源 半合成抗体库 全合成抗体库 第一个合成的噬菌体抗体库是Barbas等 1992年报道将合成的一小段CDR3片段 Company Logo 2 7噬菌体抗体库的分类 2 按抗体基因的动物来源分类 鼠源性抗体库 人源性抗体库 驼源性抗体库 Company Logo 从抗体库中可筛选多种重要的抗体 如膜 蛋白抗原 自身抗原 病毒抗原的抗体 这些显示出抗体库技术的应用潜力 实例 Burmester等构建了青霉素免疫单链抗体库 Yuan等从7个不同的人种 共47个健康人类的 血液中提取基因 构建了人源天然单克隆抗体 噬菌体抗体库 第三章 细菌的检测与治疗 噬菌体感染相应细菌后 迅速繁殖并产 生子代噬菌体 利用该特性可将已知噬菌 体加入被检材料中 如果噬菌体效价增强 就证明被检样品中有相应细菌存在 应 用此原理可以对细菌进行检测 3 1生物扩增法 原理 当样品中的待检细菌数目较少时 将不利于 噬菌斑的形成 影响检测结果 如果加入能够被 噬菌体裂解的辅助菌 被侵染的待检细菌裂解释 放出来的子代噬菌体会立刻继续吸附裂解辅助菌 从而形成清晰的噬菌斑 因此根据噬菌斑的数 目检测样品中病原菌的含量 将待检细菌的噬菌体与样品混 合 37度培养1h 仅待检细菌 被噬菌体吸附侵染 加入灭病毒剂灭活5min 灭活 所有未侵染宿主细胞的噬菌体 将辅助菌加入到样品中 中和 灭病毒剂 并立刻混合后倒入 琼脂平板进行培养 释放出来的子代噬菌体裂解辅 助菌 平板中形成清晰可见的 噬菌斑 3 1生物扩增法 该方法的关键是选择合适的灭病毒剂 其 中化学试剂硫酸亚铁铵最为常用 利用该 法已成功的检测出结核杆菌 沙门氏菌 李斯特菌 大肠杆菌 绿脓假单胞菌和弯 曲杆菌等 3 2荧光标记法 原理 荧光标记检测技术是指利用荧光染料制备荧光 噬菌体 利用这种噬菌体的荧光特性来检测病原菌 的方法 以食源性沙门氏菌的检测为例 鸡蛋中检测到的沙门氏菌 方法 荧光标记O I噬菌 体的制备与收集 荧光标记的O I噬 菌体侵染宿主菌 荧光显微镜 观察结果 O I噬菌体液与1 SYBRR染料 按10 1的比例混合 摇匀 在 暗处作用10 min 0 2 m过滤收集荧光标记的噬 体 1 PBS缓冲液冲洗2 3次除 去标记噬菌体后多余的染料 最 后去离子水洗涤滤膜回收噬菌 体 将待检样品于37 静止培养6 h预增菌后 加入荧光标记的O I噬菌体暗处侵染20min 加 入 4 多聚甲醛终止反应 0 2 m滤膜过滤收集 沙门氏菌阳性者均出现明显的 杆状荧光 即带有荧光标记的 沙门氏菌 检测结果 荧光标记噬菌体O I对食品样品检测结果 沙门氏菌 O I 噬菌体 3 3与生物传感器联用检测方法 原理 根据具有专一裂解特点的烈性噬菌体能够将特 异性的细菌裂解释放出胞内物质 如酶 通过 生物传感器监控细菌胞内某种物质的信号变化 即可检测出致病菌 利用这种方法可以在6 8h内检测出 1CFU 100mL的大肠杆菌 与生物传感器联用的噬菌体检测技术操作简单 分析速度快 但由于生物传感器抗干扰能力差 可靠性低 生物传感器在病原体检测中的应用受 到一定的限制 3 4应用报告噬菌体法检测致病菌 原理 应用DNA重组技术将报告基因首先插入 到噬菌体DNA上 将带有报告基因的噬菌 体与待检样品作用 随着报告基因在宿主 菌中的表达 目标菌体便可快速得到检测 含有报告基 因的噬菌体 宿主菌 常用的报告基因有 绿色荧光蛋白基因 gfp 2 细菌荧光素酶基因 lux 1 半乳糖苷酶基因 lacZ 3 带有荧光素酶基因 lux 的噬菌 体在体外不发光 但当该噬菌 体吸附侵染宿主细菌后 发光 基因得以表达 因此 噬菌体 在宿主细胞体内可以发光 含有gfp基因的噬菌体侵染特 定的宿主菌后 该基因在宿主 菌中表达并产生绿色荧光蛋白 再用荧光显微镜观察即可检 测待检样品中有待检菌 检测实例 E coli用以上三种基因均可进行检测 噬菌体治疗 噬菌体对一些细菌 具有高度的专一性 当 噬菌体侵染细菌时 可 在细菌中繁殖并杀死 细菌 而它对动植物没 有毒性 根据噬菌体 的这一特性可对细菌 性疾病进行治疗 早期噬菌体治疗 1917年 加拿大微生物 学家Herelle 在田野中进行 了噬菌体治疗 鸡沙门菌感染 的研究 并获 得了成功 1919年 1921年 Herelle在巴黎 医院给一个患 有痢疾的男孩 实施抗痢疾噬 菌体治疗 治疗 后病人的症状 消失并康复 Bruynoghe和 Maisin将噬菌 体注射到外科 手术伤口部位 治疗了葡萄球 菌的感染 噬菌体治疗感染的近期研究 3例确诊为结核性口腔溃疡患者采用分枝杆菌噬 菌体软膏涂抹 均在1周内开始愈合 2 4周全部 愈合 刘晓彬等应用噬菌体治疗肠源性铜绿假单胞菌感 染的动物模型 有明显的治疗作用 Matsuzaki等采用噬菌体 MR11治疗金黄色葡萄 球菌的感染 噬菌体治疗范围 噬菌体治疗敏感性致病菌的范围相当广泛 如 葡萄球菌属细菌 埃希菌属细菌 克雷伯菌属细 菌 变形杆菌属细菌 假单胞菌属细菌 弧菌属 细菌 放线菌属细菌 分枝杆菌属细菌等 治疗的疾病包括化脓性伤口感染 胃肠炎 脓 毒症 骨髓炎 皮炎 脓胸 肺炎 脑炎 细菌 性腹水 痢疾和霍乱等 噬菌体制剂 活噬菌体制剂 1 噬菌体尾部样细菌素 1 裂解酶制剂 2 是双链DNA噬菌体在自身复 制晚期合成的一类细胞壁水解 酶 能作用于细菌细胞壁的肽 聚糖 破坏细菌保护层 所以可 作为起杀菌作用的治疗药物 是由噬菌体的碎片组成的高分 子质量颗粒 它能消除目标菌 从而达到治疗的目的 可由 许多来自肠杆菌科和其他革兰 氏阴性细菌的噬菌体产生 噬菌体治疗较抗生素治。