油棕WRKY转录因子的全基因组鉴定与分析.docx

油棕WRKY转录因子的全基因组鉴定与分析 周丽霞 曹红星摘要：該研究从NCBI网站下载油棕全基因组序列信息，从TheArabidopsisInformationResource（TAIR）数据库中下载得到拟南芥WRKY转录因子序列，并在油棕基因组数据库中进行BLAST同源序列比对分析，通过NCBI工具CDD和PFAM数据库进行蛋白结构与分析，剔除无WRKY结构域的系列，利用生物信息学方法对油棕WRKY转录因子进行分析及功能预测结果表明：（1）从油棕基因组数据库中发掘WRKY转录因子95个，该WRKY转录因子蛋白质所编码氨基酸大小为116～1303bp，95个均为亲水性蛋白，总体为不稳定蛋白（EgWRKY25和EgWRKY56除外），60个蛋白以α-螺旋为主要二级结构元件，35个以无规卷曲为主要二级结构元件2）保守结构域系统进化树结果表明，油棕WRKY转录因子家族蛋白主要分为三大类，即I、Ⅱ和Ⅲ类，其中I类分为IC、IN亚类，Ⅱ类分为Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc和Ⅱd亚类3）内含子和外显子结构显示，EgWRKY基因结构进化高度保守以上结果为油棕WRKY转录因子的挖掘、功能分析及分子生物学研究奠定了基础，同时为分子育种和遗传改良提供了参考。

关键词：油棕，基因组，WRKY转录因子，生物信息学，表达分析：Q943：A：1000-3142（2020）07-0977-11Abstract：Genome-widesequenceinformationofoilpalmfromNCBIwebsite，andtheWRKYtranscriptionfactorsequencefromTheArabidopsisInformationResource（TAIR）Databaseweredownloaded，BLASThomologysequencealignmentanalysiswascarriedoutinoilpalmgenomedatabase.ProteinstructureandanalysiswerecarriedoutthroughCDDandPFAMdatabaseofNCBIonlinetool，andtheserieswithoutWRKYdomainwereeliminated.BioinformaticsanalysisandfunctionalpredictionofWRKYtranscriptionfactorinoilpalm.Theresultswereasfollows：（1）Atotalof95EgWRKYtranscriptionfactorswereexcavated，andtheyencoded116-1303bpaminoacids，predictinghydrophilicandunstable（exceptforEgWRKY25andEgWRKY56）.Themainstructureof60EgWRKYproteinswasα-helix，andtheremaining35proteinswereirregularcurl.（2）ThephylogeneticanalysisonconserveddomainshowedthatEgWRKYtranscriptionfactorfamilyproteinsweredividedintothreecategories（I，ⅡandⅢ）.CategoryIcouldbeseparatedintoICandIN，andCategoryⅡwasclassifiedintoⅡa，Ⅱb，ⅡcandⅡd.（3）Theintron-exonstructureanalysisrevealedthatstructuresofEgWRKYgenewerehighlyconserved.ThisresearchwilllayafoundationforthestudyofWRKYtranscriptionfactorexacavation，functionanalysis，andmolecularbiologyofoilpalmandprovidereferencesforitsgeneticmodificationandmolecularbreeding.Keywords：oilpalm，genome，WRKYtranscriptionfactors，bioinformatics，expressionandanalysis植物经过长期的进化，自身形成了一套对抗不良环境的适应机制，植物受到胁迫后，通过相应的信号传递途径，诱导相关基因的表达以抵御胁迫，而基因的表达受到转录因子的调控（谢政文等，2016）。

转录因子又称反式作用因子，其作为一类重要的调控基因，主要通过与基因启动子区域中的顺式作用元件结合来发挥调控作用，近年来已成为基因挖掘与功能分析领域的研究热点（贾翠玲和侯和胜，2010）转录因子的特点为含有DNA结合域、转录调控区、核定位信号区及寡聚化位点等结构根据DNA结合域结构的不同，转录因子又可分为MYB、WRKY、NAC、Zinxfinger（锌指蛋白）等诸多家族（伍林涛等，2013）WRKY作为植物中最大的转录因子家族之一，通过结合植物次生代谢产物合成途径关键酶基因的启动子元件来调控植物的代谢过程（丁蒙蒙等，2018）WRKY的N-末端具有7个高度保守氨基酸残基WRKYGQK，C端有1个非典型的锌指结构，其结构域由近60个氨基酸组成根据WRKY结构域的数目及锌指结构的类型，WRKY蛋白可分为三个类型：第一类为含有2个WRKY结构域，锌指结构的类型为C2H2;第二类为含有1个WRKY结构域，锌指结构的类型为C2H2;第三类为含有1个WRKY结构域，锌指结构的类型为C2HC（伍林涛等，2013）WRKYcDNA最初是从甘薯中克隆出来的（Ishiguro&Nakamura，1994），随后在其他植物如欧芹（Rushtonetal.，1995）、野燕麦（Rushtonetal.，1996）、拟南芥（Pateretal.，1996）、水稻（孙利军等，2014）、枣树（Xueetal.，2019）等不同物种中分离鉴定出来。

谷彦冰等（2016）利用WRKY保守域全蛋白序列鉴定出61个桃WRKY基因，通过生物信息学分析发现桃WRKY蛋白分为I、Ⅱ和Ⅲ类型，应用半定量和荧光定量PCR技术发现有16个WRKY基因均在桃的根、茎、叶、花和果重表达刘潮等（2017）基于桑树全基因组蛋白数据库，鉴定出55个桑树WRKY基因，通过系统进化分析将WRKY蛋白分为I、Ⅱ和Ⅲ類型，应用保守结构域分析发现WRKY蛋白序列高度保守，在植物抵御非生物胁迫过程中发挥作用包昌艳等（2018）应用“红阳”猕猴桃全基因组数据，鉴定出89个WRKY基因，通过进化分析发现WRKY蛋白可分为I、Ⅱ和Ⅲ类型，有33个WRKY基因在猕猴桃根、叶、花和果四个器官中均有显著表达Feietal.（2019）从陇南大红袍花椒中分离鉴定出38个WRKY家族成员，其中ZbWRKY33是对干旱胁迫反应最敏感的成员之一，通过直接与乙烯合成前体基因asc结合调节花椒抵御干旱的能力由此可见，诸多植物中WRKY转录因子均得到鉴定与分析，但目前针对油棕WRKY转录因子基因及蛋白质的鉴定与生物信息学分析的研究鲜见报道，本研究基于油棕基因组数据，利用生物信息学方法全面分析油棕WRKY转录因子家族结构及特征，为深入研究WRKY转录因子家族的生物学功能奠定基础。

1材料与方法1.1EgWRKY序列获取与鉴定油棕全基因组序列从NCBI下载获得，拟南芥WRKY基因序列从TheArabidopsisInformationResource（TAIR）数据库中下载获得（http：//www.arabidopsis.org），以拟南芥WRKY序列为探针，阈值设定为e-10，在油棕基因组数据库中进行同源序列比对分析得到油棕WRKY基因序列，将得到的油棕WRKY基因序列在美国麻省理工学院基因扫描服务器（TheGENSCANWebServeratMIT）搜索以获得WRKY蛋白序列，通过NCBI工具CDD（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）和PFAM数据库（http：//pfam.xfam.org/）进行蛋白结构域分析，剔除无WRKY保守结构域的蛋白序列1.2方法1.2.1EgWRKY蛋白理化性质分析利用ProtParam分析EgWRKY蛋白的理化性质，利用NetPhos3.1Server和DictyOGlyc1.1Server预测氨基酸序列磷酸化及O-糖基化修饰情况，利用ProtScale分析蛋白质的亲/疏水性，利用SignalP和ProtComp预测蛋白的信号肽和亚细胞定位预测，应用SOPMA预测蛋白的二级结构。

1.2.2EgWRKY的进化树、外显子及内含子分析应用MEGA6.06软件构建EgWRKY进化树，执行参数为Neighbor-Joining，Bootstrap重复1000次2结果与分析2.1EgWRKY转录因子家族成员基本信息基于油棕全基因组数据及拟南芥WRKY基因序列，通过BLAST搜索同源序列和WRKY蛋白保守结构域鉴定，共挖掘95个油棕WRKY转录因子成员由表1可知，该95个蛋白质所含氨基酸大小为116～1303bp，其中蛋白氨基酸数目小于300aa的基因序列占35.8%，介于300～700aa的基因序列占57.9%，大于700aa的基因序列占6.3%2.2EgWRKY蛋白理化性质分析利用ProtParam软件（http：//expasy.org/tools/protparam.html）分析EgWRKY蛋白的基本性质，预测结果如表2所示95个WRKY蛋白中，56个蛋白的理论等电点（pI）小于7，39个蛋白的pI大于7，pI最小值为4.74（EgWRKY73），最大值为10.18（EgWRKY84），平均pI为7.15;EgWRKY25和EgWRKY56蛋白质的不稳定系数小于40，为稳定蛋白，其余93个EgWRKY蛋白的不稳定系数大于40，为不稳定蛋白，该结果表明EgWRKY转录因子家族大多为不稳定蛋白。

利用NetPhos3.1Server软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）预测氨基酸序列磷酸化;利用DictyOGlyc1.1Server软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/DictyOGlyc/）预测氨基酸序列的O-糖基化修饰情况，发现平均磷酸化位点有37.8个，O-糖基化位点有1.6个;利用ProtScale软件（https：//web.expasy.org/protscale/）分析蛋白质的亲/疏水性，从EgWRKY蛋白的脂肪系数来看，该95个EgWRKY蛋白的脂肪系数均小于100，该结果表明其均为亲水性蛋白;利用SignalP5.0软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测蛋白的信号肽，发现5个EgWRKY蛋白存在信号肽（EgWRKY29、EgWRKY3。