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实时荧光定量PCR检测限的统计推断来源：中国论文下载中心作者：王文清，王昌富，袁琳，彭长华，常武【摘要】 检测限是检测方法的重要性能指标，用Poisson分布的概率函数分式计算一次抽 样检测出现的结果推论总体出现该结果的概率以实时荧光定量PCR(FQDPCR)检测乙型肝 炎病毒DNA结果为例，计算可知，一次抽样反应管的检测结果24时，才可推论总体与0(空 白)差异有显著性(P<0.05)因而检测血清中病原体时扩增反应管中的检测限是4拷贝/ul计 算也可知，1拷贝/ul表示一次抽样的结果为0的概率可达0.368，结果在0拷贝/ul〜4拷贝 /ul的概率为0.996,而1000拷贝/ml表示一次抽样结果为0的概率为0结果在905拷贝/ml〜 1 095拷贝/ml的概率为0.997；而100 000拷贝/L表示一次抽样结果在997 000拷贝/L〜1 003 000拷贝/L的概率为0.997抽样单位ul不能随意放大为ml甚至L关键词】实时荧光定量PCR；检测限；统计推断Statistical Conclusion of Limit of Quqntitation in RealDtime Fluorescence Quantitative PCRAbstract:Limit of quantiation is a important performance index of assay methods.Results of sample drawing are calculated through possiblity function equation of Poisson distribution,then the possibility of results emerged in population is deduced.For example,in RealDtime Fluorescence quantitaive PCR to assay HBV DNA,only when sample drawing results>4,significance of difIerence(P<0.05)could be deduced between population and blank.So limit of quantitation is 4 copies/ul denoting 0 in one sample drawing is 0,and Possibility of results between 905 copies/ml to 1095 copies/ml is 0.997.Possibility of 100 000 copies/L denoting results between 997 000 copies/L to 1 003 000 copies/L in one sample drawing is 0.997.Sample drawing unit ul could not be replace by ml or L.Key words： RealDtime Fluorescence quantitative PCR； Limit of quantitation; Statistical conclusion检测限是检测方法的重要性能指标，只有在检测报告中明确表达了检测方法的检测限， 该检测报告在各实验间及同一项目的各种检测方法间才可进行比较。

能检测到的最低分析物 浓度为检测系统的检测限当前，检测限术语混乱，如：灵敏度(sensitivity).分析灵敏度 (analllytical sensitivity)、定量限度(limit of quantitqtion)等［1］每个词语的实际含义中包含 有各自的实验方式、数据处理方式及由数据作出的推论等我们采用统计学方法，以期得到 一致的实时荧光定 量 PCR(Real Dtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ DPCR)检测限，现介绍如下1文献中FQDPCR检测限的描述检测乙型肝炎病毒DNA的文献中检测限使用了“最低检出量” ［2, 3］、灵敏度［5-7］ 等术语，它等于已知的高拷贝HBV DNA血清10倍系列稀释后能检测到扩增曲线的最大稀 释倍数管浓度表述有：阴性HBV DNAM106拷贝/升［4］；荧光定量PCR法检测灵敏度 102 拷贝/ml ［5］、104 拷贝/ml ［6］、8.6x102 拷贝/ml ［7］； HCDH 法检测灵敏度 1.4x105 拷贝/ml ［7］； 103 Eq/ml理论值时到达检测极限［3］； PCRDFP检测HBV DNA的最低检 测出量1x101拷贝［2］； bDNA在105 Eq/ml时到达检测极限［3］。

以上检测限术语各不 相同，且同一方法检测HBV DNA在上述各实验室发出同样的“HBV DNA低于检测下限”的 报告时其实际HBV DNA拷贝数相差可达100倍2 FQDPCR检测过程简介以测定血清乙型肝炎病毒DNA为例：将40 pl血清样本加40 pl DNA提取液处理后， 将其中2 pl （相当于1 pl血清）加入主反应液（含DNA引物、酶、DNA构件分子dNTP等） 管中，在自动热循环上进行温度循环，自动热循环仪记录每一反应管在每一次温度循环的荧 光强度，记30次温度循环后结束在PCR循环过程中，每个反应管内的荧光信号到达设定 的域值时所经历的循环数称为Ct值（Cyclethreshold）,它与反应管中DNA起始拷贝数的对数 值（lgN）旱非常显著的直线相关关系自动热循环仪对标准样品自动生成一条Ct值对于起 始拷贝数值（lgN）的工作曲线，并通过该工作曲线来确定待测未知样品反应管的起始拷贝数 （N）当30次循环后某一待测管仍检测不到高于基线水平的荧光信号时，仪器默认Ct值 为30，不计算起始拷贝3确定FQDPCR检测限的统计学原理如果被检物的含量和检测方法的空白响应量的波动服从正态分布规律，则检测限可用多 次检测空白的方法来确定。

可信限为95%时检测限=乂空白+2.s空白；可信限为99.7%时检 测限=x空白+3.s空白这是目前多数检测限的确定方法对核酸检测方法的检测限的理解 可能与此有差别，但是原理应是一致的［1］，FQDPCR检测限也应是推论总体与空白有统 计学差异的最小抽样结果4 FQDPCR检测限的统计推断假设病原体在血液等体液中的分布是随机的，则单位体积中（如1.0 pl）病原颗粒数的分 布服从Poisson分布以Poisson分布的概率函数公式计算一次抽样检测出现的结果推论总 体概率从理论上来说，使用PCR测定技术测定病原体核酸序列的量可低至1个拷贝［2］ 例如：血清标本中加入等量的DNA提取液，于离心管中煮沸，4 °C放置，离心，吸取上清 液2 pl作模板进行扩增检测（2 pl上清液相当于抽样1 pl血清）［2］，其中至少有1个拷贝 的HBV DNA才能有典型扩增反应，这时检测结果是1拷贝/pl由Poisson分布的概率函数 公式可计算出1次抽样检测结果出现0时，推断总体为1〜9的概率见表1表1总体为1〜9时抽样为0的概率及总体（略）在FQDPCR检测HBV DNA中，当30次循环后某一待测管仍检测不到高于基线水平的 荧光信号（即当C仑30），反应管检测结果为0时，推论总体拷贝数为1〜9的概率之和〉0.58192,总体为其他的概率之和＜0.5(此时报告0拷贝的可信限度低于50%)。

总体为1时一次抽 样结果分别为1〜9时的概率见表1当一次抽样结果24时，推论总体为1的概率＜0.015 33, 所以对于病原体的检测，一次抽样反应管检测结果^拷贝时，才可推论总体与0(空白)差异 有显著性(P＜0.05)因而上述检测血清中病原体时一次抽样反应管的检测限是4拷贝/gl当 总体为1、2、3时一次抽样结果为0的概率分别是0.367 88、0.135 34、0.049 79如室间质 量评价样本靶值选择1拷贝/gl、2拷贝/gl、3拷贝/gl时，无论实验室实际检测质量如何高， 都将有36.79%、13.53%、4.98%的实验室检测结果为0而被判为不符合［按靶值的对数值 GM±0.5 log(10) ［9］作为可接受的定量范围］2005年卫生部室间质量评价中靶值为1.51 拷贝数/gl的样本符合率仅35.2%； Mancini C等［9］报道一些实验室对检测下限附近的样 本(3.00 log IU/ml)准确定量有困难；Raggi CC等［10］也报道28.6%的实验室(12/42)对最低 浓度的样本不能定量这些都是因为检测下限附近的样本一次抽样结果为0的概率太大所 致，对此我们将另文详细讨论。

造成上述文献中检测限差异较大的可能原因如下：用于10 倍系列稀释的已知高拷贝HBV DNA血清本身拷贝数的差异；对检测限的理解差异，由一次 抽样没能检测到典型扩增的稀释血清管推论总体浓度为0的可信度太低(＜50%)；抽样单位 的任意放大：在上述HBV DNA检测中，抽样单位是1 gl血清［如血清前处理过程中有抽 提(浓缩)过程，取2 gl上清液相当于实际含12.5 gl血清，则抽样单位也只是12.5 gl］，而 报告结果的单位是ml甚至L当总体为1拷贝/gl时表示一次抽样结果为0的概率达0.368, 结果在0拷贝/gl〜4拷贝/gl的概率为0.996；而总体为1 000拷贝/ml时表示一次抽样结果为 0的概率为0，结果在905拷贝/ml〜1 095拷贝/ml的概率为0.997(Poisson分布总体＞50时近 似正态分布，范围是X士uaNx，可信限为99.7%时ua=3);总体为100 000拷贝/L时表示一次 抽样结果在997 000拷贝/L〜1 003 000拷贝/L的概率为0.997文中推理以HBVDDNA的 FQDPCR检测为例，其他病源体核酸的FQDPCR检测也与其相同，检测限是抽样反应管的 检测限4拷贝/反应管；如反应管中加入模板量相当于12.5 gl血清则检测限相当于0.32拷贝 / gl。

此推断仅是针对FQDPCR技术本身的检测限度，未就临床上有意义的最小病源体核酸 的拷贝数进行讨论参考文献】［1］冯仁丰.分析灵敏度(检测限)［J］.上海医学检验杂志，2002，17(3)： 133D134.［2］ 郭晏海，张菊，赵锦荣，等聚合酶链反应荧光偏振技术在乙型肝炎病毒DNA检 测中的应用及价值［J］.中华检验医学杂志，2004，27(1)： 26D27.［3］ 张东华，金根娣，陆志檬.二种分子杂交技术定量检测临床标本中HBV DNA的 比较［J］.上海医学检验杂志，2003，18(3)： 163D164.［4］ 何敏，杨朝霞，刘微，等.HBV DNA定量检测方法的评价［J］.国外医学临床生 物化学与检验学分册，2005，26(2)： 123D124.［5］ 刘停，韩亚萍，张永祥.荧光定量PCR检测慢性乙型肝炎患者血清HBVDDNA 及其意义［N］.南京医科大学学报，2003，23(1)： 78D79.［6］黄希田，颜鸣鹤，凌乔，等.定量PCRD微流芯片法定量检测血清HBV DNA含 量.中国感染控制杂志，2003, 2(2)： 89D91.[7] 王豪，陶其敏，吴娟，等.两种乙型肝炎病毒DNA定量检测方法的比较与评价[J]. 中华检验医学杂志，2002，25(5)： 318D320.[8] 李金明，邓巍，王露楠，等.PCR测定乙型肝炎病毒DNA弱阳性质控血清的适 用性研究[J].临床检验杂志，2000，18(1)： 6D7.[9] Mancini C,Pisani G,Azzi A,et al.InterDlabortory c。