凋亡抑制蛋白Livin在肝癌组织中的表达及其临床意义.pdf

山西医科大学硕士学位论文凋亡抑制蛋白Livin在肝癌组织中的表达及其临床意义姓名：乔芳珍申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：赵浩亮20060531山西医科大学硕士学位论文凋亡抑制蛋白L i v i n 在肝癌组织中的表达及其临床意义摘要目的：探讨凋亡抑制蛋I 兰f ( i n h i b i t o r o f a p o p t o s i s p r o t e i n ，I A P ) L i v i n 在人原发性肝癌( H C C ) 组织中的表达及其表达与肝癌某些临床特征之间的关系方法：应用免疫组织化学( s P ) 染色技术和图像分析技术，检测人4 8 例原发性肝癌( H C C ) 组织、2 0 例肝硬化组织及1 2 例正常肝组织中L i v i n 蛋白的表达情况，分析其表达与肝癌各临床指标之间的关系结果：免疫组织化学( S P ) 染色结果显示，L i v i n 蛋白在1 2 例正常肝组织中均不表达，在2 0 例肝硬化组织中有3 例呈阳性表达，两组之问差异无显著性( p > O ．0 1 2 5 ) ；而4 8 例原发性肝癌组织中有3 3 例呈阳性表达，与肝硬化组和正常肝组织组相比表达率显著升高，差异有显著性( p 0 ．0 5 ) ；且L i v i n 蛋白的表达与肝癌患者的发病年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、甲胎蛋白( A F P ) 、是否合并乙肝、肝硬化等均无显著性差异( p > 0 ．0 5 ) ，而与肝癌是否发生转移有显著性差异( p O ．0 5 ) ．B u ti th a dr e l a t i o n s h i pw i t ht h et r a n s f e ro fH C C ( p 5 0 ％为( 十+ 十) Ⅲ。

4 ．图像分析：将染色后的切片在I d l A S 一2 0 0 0 图像分析软件系统( 四) t i n 大智胜软件股份有限公司)中，用免疫组织化学定量软件进行定量分析所钡4 得的灰度范围在0 —2 5 5 之间，每张切片随机观察5 个视野( ×1 0 0 ) ，用细胞图像分析软件测量，阳性细胞着色强度用灰度值表示，取其平均值，得到目标平均灰度值( G ) ，灰度值越高，着色强度越低，灰度值越低，着色强度越高同时测定阳性细胞( 目标) 面积、视场面积、面积密度( A ．目标面积／视场面积) 、视场平均灰度值( G ，) ，计算阳性单位( P U 值) ，用均数±标准差表示P u 值越大，阳性程度越强：P U 值越小，阳性程度越弱P u 值= ——i i 二器×1 0 0 ( h m a x = 2 5 5 )5 ．统计学处理：L i v i n 蛋白在原发性肝癌、肝硬化、正常肝组织之间的表达率情况，以及L i v i n 蛋白的表达与原发性肝癌各临床指标之间的关系应用x2 检验、F i s h e r 确切概率法L i v i n 蛋白在原发性肝癌、肝硬化、正常肝组织之间的灰度值与阳性单位的比较采用方差分析。

结果1 ．不同肝脏组织中L i v i n 蛋白免疫组织化学方法检测结果：( 见图1 - 5 )1 ．1L i v i n 蛋白基因的表达及定位：L i v i n 蛋白阳性染色定位于肝细胞胞浆，呈棕黄色颗粒1 ．2L i v i n 蛋白基因的表达结果：在4 8 例肝癌组织中有3 3 例表达L i v i n 蛋自，阳性率为6 8 ．7 5 ％；其中1 1 例L i v i n 呈强阳性表达，1 3 例阳性表达，9 例弱阳性表达；2 0 例肝硬化组织中仅3 例检测到L i v i n 蛋白的表达，阳性率为1 5 ％；而正常肝组织中未出现L i v i n蛋白的表达 见表1 )表，L i v i n 蛋白在不同肝组织中的表达情况注：肝癌组与肝硬化组比较，p o ．0 1 2 5肝癌组织与肝硬化组织、肝癌组织与正常肝组织中L i v i n 蛋白的表达经统计学检验差异有显著性( p 0 ．0 1 2 5 ) L i v i n 蛋白在肝癌组的表达率较肝硬化组与正常肝组织高，表明L i v i n蛋白的表达与肝癌的发生、发展有关2 ．图像分析方法检溯结果( 见表2 )将免疫组织化学染色后的切片，用M I A S 图像分析定量系统检测之后，图像分析量化结果显示，原发性肝癌组的平均灰度值与肝硬化组及正常肝组织组相比明显降低，有统计学差异( p 0 ．0 5 ) 。

可以认为L i v i n 蛋白在肝癌组的表达强度高于肝硬化组与正常肝组织组山西医科大学硬士学位论文表2L i V i n 蛋白免疫组织化学切片图像分斩检测结果( 冤±S )注：△F = 4 0 ．1 5 ，p 0 ．0 5▲F = 4 4 ．4 5 ，p 0 ．0 53 ．原发性肝癌组织中L i v i n 蛋白的表达与临床病理学的相关性分析：( 见表3 ) 进一步分析L i v i n 蛋白的表达与原发性肝癌某些临床特征的之间的关系，经统计学检验，L i v i n 蛋白的表达与肝癌的发病年龄( p > O ．0 5 ) 、性另r J ( p > 0 ．0 5 ) 、肿瘤大小( p > O ．0 5 ) 、A F P ( p > 0 ．0 5 ) 、是否合并乙肝( p > O ．0 5 ) 、肝硬化( p > O ．0 5 ) 以及肿瘤的分化程度( p > O ．0 5 ) 等均无统计学差异，而与肝癌是否发生转移有统计学差异Q < o ．0 5 ) 山西医科丈学硬士学位论文表3L i v i n 表达与H CC 临床特征的关系例数( n )阳性百分比( ％)x2 值p 值6山西医科丈学磺士学位论文讨论细胞凋亡是调节机体平衡的重要机制，生理状态下凋亡途径可清除体内衰老和异常的细胞，保持体内组织的动态平衡。

目前，国内外对肿瘤的研究较多，普遍认为，肿瘤的发生原因虽然尚不完全清楚，但许多研究表明，肿瘤的发生不仅与细胞的增殖和分化异常有关，与细胞的凋亡失衡也有密切的关系，受细胞内外多种因素控制因此，研究细胞凋亡在肿瘤发生、发展中的作用，对于弄清肿瘤的发病机制及探索肿瘤新的治疗方法具有重要的意义凋亡抑制蛋I 刍( i n h i b i t o ro f a p o p t o s i sp r o t e i n ，l A P ) 是一类内源性细胞抑制因子，是首先由C r o o k [ 2 】等于1 9 9 3 年在杆状病毒C p G V 和O P M N P V 中发现并分离出来的一类新的独立于B c l ．2 的抗凋亡蛋白目前人类已发现8 种I A P s ：C I A P l ( H I A P I ) 、C I A P 2 ( H I A P 2 ) 、N I A P 、X I A P ( I L P I ) 、I L P 2 、s u r v i v i n 、B r u c e 及新成员L i v i n ( 又称M Ll A P 和KI A P ) l } ”它在很多物种起抑制凋亡的作用，其过度表达引起的凋亡不足与肿瘤的发生有密切的关系。

与其他凋亡抑制蛋白如P3 5 或者C r m A 比较，I A P s 有着更广泛的抗凋亡作用I A P s 主要通过抑制c a s p a s e 蛋白的活性，参与肿瘤坏死因子( T N F ) 介导的信号转导，与核因子xB 相互作用发挥抗细胞凋亡作用除此之外，l A P s 还参与细胞周期的调控，调控多种信号的转导I A P s 家族结构功能相似，通常包含2 ．3 个串联的含有半胱氨酸／组胺酸( C y s ／H i s ) 的杆状病毒I A P 重复序列( B I R 结构) 和一个锌指结构( R I N G ) ，其B 1 R 结构是其发挥功能的主要单位I A P s 家族的组织分布差异很大，在肿瘤组织中常出现I A P s 的过度表达，尤其是s u r v i v i n 和L i v i n 的分布具有肿瘤组织特异性L i v i n 蛋白是近年来发现的人类l A P s 家族的新成员，最初从人类胚肾c D N A 克隆得到，称为KI A P ( k i d n e yi n h i b i t o ro f a p o p t o s i sp r o t e i n ) 。

由于该基因在黑色素瘤细胞中高度表达，也叫做M Ll A P ( m e l a n o m ai n h i b i t o ro fa p o p t o s i sp r o t e i n ) 瞵J 与其它成员一样，L i v i n 含有高度保守的约7 0 a a 的B I R ( b a c u l ov i r a lI A Pr e p e a 0 结构域( 结合和抑制死亡蛋白酶的关键部位)和羧基末端环指结构( R I N G ) ，其高级结构与s u r v i v i n 很相似L i v i n 在正常成人的大多数终末分化组织中( 除胎盘) 均低表达或不表达，表皮、淋巴、脾脏和黑色素细胞表达很低在胎儿发育过程中多种组织高表达，如胎儿的脑、胸腺、肾和肝[ 8 - 9 1 研究表明，L i v i n 在多数肿瘤中高表达，如黑色素瘤、乳腺癌、富颈癌、结肠癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、白血病、肺癌以及淋巴瘤等l l o ’B J 然而，尚未见有关肝癌组织L i v i n 蛋白表达情况以及其与肝癌临床特征之间关系的报道此外，L i v i n 存在两种异构体( L i v i na 和L i v i n B ) ，前者c D N A全长8 9 7 b p ，编码2 9 8 a a 蛋白，约3 3 k D ：后者c D N A 全长8 4 3 b p ，编码2 8 0 a a 蛋白，约3 0 k D 。

分别含有1 3 5 1 和1 2 9 7 碱基，两者除相差一段5 4 个碱基以外，其他完全一致，在功能上没有本质的差5 i , J t ”J L i v i n 蛋白基因定位于细胞内微丝结构和细胞核，在高表达L i v i n 的M C F 7 乳腺癌细胞系中，L i v i n C 末端的R I N G 结构与细胞内微丝结构结合，从而定位在细胞骨架因此，L i v i n 蛋白主要在细胞质中，不定位在纺锤体上【I “C a s p a s e s 蛋白是介导细山西医辩大学硬士学位论文胞凋亡的重要蛋白家族，大多数刺激物是通过C a s p a s e s 蛋自的级联激活反应引起细胞凋亡的L i v i n 蛋白通过其B I R 结构域能与C a s p a s e s 蛋白多个成员相互作用，尤其是C a s p a s e s ．3 ，阻止C a s p a s e s 蛋白在细胞凋亡时执行蛋白切除功能，从而起到抑制凋亡的作用基于L i v i n的抗凋亡功能和独特分布，提示L i v i n 蛋白与肿瘤发生、发展之间可能存在密切的联系，对于这种联系相关性的探讨成为人们关注的热点本研究通过采用免疫组织化学技术和图像分析技术检测肝癌组织、肝硬化组织及正常肝组织中L i v i n 蛋白的表达。

结果表明，L i v i n 蛋白在原发性肝癌组织中的表达率及表达强度均较肝硬化及正常肝组织高，差别分别有统计学意义提示L i v i n 蛋白的表达可能在肝癌的发生、发展中具有重要的作用L i v i n 蛋白的表达与肝癌的发病年龄、患者性别、A F P 、是否合并乙肝、肝硬化、肿瘤的大小及分化程度等无统计学差异；而与肿瘤是否发生转移有统计学差异，即已发生转移者较未发生转移者的表达率增高，这说明L i v i n 蛋白的表达与肝癌的生物学行为密切相关因此L i v i n 蛋白的表达与肝癌的预后之间的关系有待进一步研究目前，原发性肝癌发现晚，预后差，死亡率高，严重威胁着人类的健康，治疗仍以手术治疗方法为主虽然综合治疗已取得了较好效果，但其5 年生存率仍有待进。