生物化学酶的催化机制课件.ppt

Click to edit Master title style,,Click to edit Master text styles,,Second level,,Third level,,Fourth level,,Fifth level,,,,*,酶的催化机制,酶催化机理研究的主要方法,〔1〕找出保守性的氨基酸残基,,得到不同生物来源的同一种酶的一级结构以后，将,,它们进行比照，找出高度保守的氨基酸，可以获得一,,些可能与催化有关的氨基酸残基的信息在酶的进化,,中，保守性越高的氨基酸残基对酶的三维结构和功能,,奉献越大，这些氨基酸残基很可能直接与酶的催化机,,制有关例各种丝氨酸蛋白酶的一级结构比照，His,,〔组氨酸〕57、Asp〔天冬氨酸〕102、Ser195不变，,,事实证明，这三种氨基酸残基直接参与肽键的水解〔2〕三维结构的研究,,酶的三维结构决定了酶的功能，如果得到酶的三维,,结构信息，对酶的催化机制的研究提供最直接的线索,,获得酶三维结构的方法有X射线衍射和NMR〔3〕定点突变,,分子生物学技术的开展使对蛋白质定点突变变的很,,容易，所以只要得到一个酶的基因，就可以对其氨基,,酸序列进行任意的突变。

如果对一个酶氨基酸残基进,,行有的放矢的突变，会对酶的作用机制研究提供有价,,值的信息把胰蛋白酶活性中心裂缝底部的Asp189突,,变成不带电荷或带正电荷的氨基酸残基，胰蛋白酶活,,性完全丧失胰蛋白酶只水解碱性氨基酸残基与其他,,氨基酸氨基形成肽键，所以Asp189通过侧链的负电荷,,与底物上的碱性氨基酸残基带正电荷的侧链结合〔4〕动力学分析,,动力学分析可以为研究酶的作用机制提供有用的数,,据〔5〕化学修饰,,用双功能试剂对酶的修饰有助于确定在三维结构上,,相邻的基团借助底物或竞争性抑制剂的保护，可以,,通过化学修饰确定活性中心的氨基酸残基的性质例：假定一个酶分子上有6个Csy残基，但又无法确,,定它的活性中心是否有或者有几个Csy残基，可以分,,别在有或无过量底物存在下，用碘代乙酸修饰酶，然,,后进行比照，在底物保护的情况下，不能被修饰的,,Csy残基就在活性中心过渡态稳定学说,根据过渡态理论，在任何一个化学反响体系中，反响物需要到达一个特定的高能状态以后才能发生反响这种不稳定的高能状态被称为过渡态到达过渡态要求反响物必须含有足够的能量以克服活化能，然而，一个反响系统中各反响物分子具有不同的能量，只有某些反响物才含有足够的能量去进行反响。

一个双分子HA-HB和单原子HC之间形成一个新的HB-HC和HA ，反响发生需要形成不稳定的过渡态HA-HB-HC,HA-HB + HC→HA-HB-HC〔过渡态〕→HB-HC + HA,ΔG活为反响活化能HA-HB-HC为过渡态中间物过渡态中间物既不是产物，也不是底物，而是介于旧化学键减弱，新化学键开始形成的一种不稳定的结构状态活化能也不是反响的总自由能变，自由能变与反响平衡时底物浓度和产物浓度有关，而活化能与反响速度有关活化能越低含有足够能量的反响物分子越多，反响发生的越快提高温度或其他因素的作用可以促进更多的反响物到达过渡态，提高反响速度所有的催化剂都是通过降低活化能加快反响速率过渡态中间物,化学反响的过渡态及其前后的自由能变化,,酶与过渡态的亲和力要比对基态〔底物〕的亲和力高得多，酶的催化源于其对过渡态的稳定作用酶把反响分成几步，因为酶与过渡态的中间物结合比和基态〔底物〕的结合更牢、更好而稳定反响的过渡态，从而降低活化能，加快反响速度单底物反响S→P：如果没有酶，S要克服能障变为过渡态后再反响生成P如果有酶催化，通过分子碰撞，酶与底物先形成可逆复合物ESES形成的结合能一局部用来驱动过渡态复合物形成。

经过EP复合物，最终释放出产物P和自由酶E形成过渡态复合物需要的活化能比单独形成过渡态底物所需的活化能低，导致总反响活化能显著下降，所以酶促反响速率大大增加但是，酶不能改变反响的总自由能变，也就是它不影响反响的平衡方向酶促反响和非酶促反响过程的自由能变化,过渡态稳定的化学机制,与酶催化相关联的过渡态稳定是酶活性中心结构和反响性以及活性中心与结合底物之间的相互作用的必然结果酶充分使用一系列的化学机制来实现过渡态的稳定并由此加速反响这些机制归纳起来主要有六种机制：,,〔1〕邻近定向效应；,,〔2〕广义的酸碱催化；,,〔3〕静电催化；,,〔4〕金属催化；,,〔5〕共价催化；,,〔6〕底物形变邻近定向效应,邻近定向效应是指两种或两种以上的底物〔特别是双底物〕同时结合在酶活性中心上，相互靠近〔邻近〕，并采取正确的空间取向〔定向〕，这样大大提高了底物的有效浓度，使分子间反响近似分子内反响从而加快了反响速度底物与活性中心的结合不仅使底物与酶催化基团或其它底物接触，而且强行“冻结〞了底物的某些化学建的平动和转动，促使它们采取正确的方向，有利于键的形成广义的酸碱催化,广义的酸碱催化是指水分子以外的分子作为质子供体或受体参与催化，这种机制参与绝大多数酶的催化。

蛋白质分子上的某些侧链基团〔如Asp、Glu和His〕可以提供质子并将质子转移到反响的过渡态中间物而到达稳定过渡态的效果如果一个侧链基团的pKa值接近7，那么该侧链基团就可能是最有效的广义的酸碱催化剂蛋白质分子上的His组氨酸残基的咪唑基就是这样的基团，因此它作为很多酶的催化残基广义的酸碱催化和特定的酸碱催化的差异：,,〔1〕特定酸碱催化是H+或OH-加速反响，广,,义的酸碱催化是酶分子上的酸性和碱性基团催,,化反响〔2〕缓冲溶液对他们的影响不同特定酸碱,,催化反响速率只取决于pH，与缓冲溶液浓度无,,关，广义的酸碱催化，缓冲溶液有助于通过提,,供或夺取质子来稳定过渡态，反响速度取决于,,底物和酶的质子化状态，还取决于缓冲溶液的,,浓度缓冲溶液浓度的升高提高了广义酸碱催,,化的效率静电催化,活性中心电荷的分布可用来稳定酶促反响的过渡态，酶使用自身带电基团去中和一个反响过渡态形成时产生的相反电荷而进行的催化称为静电催化有时，酶通过与底物的静电作用将底物引入到活性中心溶菌酶Glu35将质子交给糖苷键上的O原子以后，O因此带上正电荷，随后糖苷键断裂，左边的糖基1号位的C原子带上正电荷，邻近的Asp52的羧根本来于解离状态，带负电荷，起着中和正电荷稳定过渡态的作用。

溶菌酶的最适,pH,与,Glu35,和,Asp52,的解离状态有关,金属催化,近三分之一酶的活性需要金属离子的存在，这些酶分为两类，一类为金属酶，另一类为金属激活酶前者含有紧密结合的金属离子，多数为过渡金属，如Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+或Co3+，后者与溶液中的金属离子松散地结合，通常是碱金属或碱土金属，例如Na+、K+、Mg2+或Ca2+金属离子参与的催化被称为金属催化金属离子以5种方式参与催化：〔1〕作为酸接受电子，使亲核基团或亲核分子亲核性更强；〔2〕与底物结合，促进底物在反响中正确定向；〔3〕作为亲电催化剂，稳定过渡态中间物上的电荷；〔4〕通过价态的可逆变化，作为电子受体或电子供体参与氧化复原反响；〔5〕酶结构的一局部共价催化,共价催化是指酶在催化过程中必须与底物上的某些基团暂时形成不稳定的共价中间物的一种催化方式许多氨基酸残基的侧链可作为共价催化剂，例如Lys赖氨酸、His组氨酸、Cys半胱氨酸、Asp天冬氨酸、Glu谷氨酸、Ser丝氨酸或Thr苏氨酸，此外，一些辅酶或辅基也可以作为共价催化剂，例如硫胺素焦磷酸〔TPP〕和磷酸吡哆醛几种酶的共价催化,,Y比X更好的离开基团，X是比Z更好进攻的基团，共价中间物的反响性比底物强。

亲核共价修饰反响,底物形变,底物形变是指当酶与底物相遇时，酶分子诱导底物分子内敏感键更加敏感，产生“电子张力〞发生形变，比较接近它的过渡态底物形变,溶菌酶也利用这种方式进行催化：与溶菌酶活性中心结合的,6,碳糖在溶菌酶的诱导下，从椅式构象变成半椅式构象而发生形变，周围的糖苷键更容易发生断裂几种常见酶的结构与功能,蛋白酶,蛋白酶是催化肽键水解的一类酶的总称尽管肽键的水解在能量学上是十分有利的，但如果没有蛋白酶的催化，一个肽键在中性pH和25℃条件下大概需要300年~600年的时间才能完成水解根据活性中心催化基团的性质，蛋白酶可以分为四类：〔1〕丝氨酸蛋白酶——此类蛋白酶的催化基团包括1个不可缺少的Ser残基，DIFP是它们的不可逆抑制剂；〔2〕金属蛋白酶——这类蛋白酶在活性中心结合金属离子，其活性绝对需要金属离子，因此金属离子的螯合剂EDTA或邻菲罗啉的存在可导致其活性的丧失；〔3〕天冬氨酸蛋白酶——其催化基团包括两个重要的Asp，在偏碱性的pH下无活性；〔4〕巯基蛋白酶——其催化基团包括1个Cys的巯基，巯基试剂为它们的不可逆抑制剂所有蛋白酶在催化过程中都经历四面体的过渡态，该过渡态形成的原因是反响涉及一个亲核基团进攻肽键的羰基碳。

如果是丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶，进攻的亲核基团分别是Ser残基的羟基和Cys残基的巯基，否那么就是水分子丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶的催化机理中包括共价催化，脂酰基酶是酶与底物的共价中间物，而金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶催化的反响更为直接，没有共价催化丝氨酸蛋白酶,这一类蛋白酶以一个特定的Ser残基作为必需的催化基团，属于该家族成员的有胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、激肽释放酶原、凝血酶、纤溶酶和组织型纤溶酶原激活剂丝氨酸蛋白酶的催化机制属于共价催化和广义酸碱催化的混合体，由三个不变的氨基酸残基构成的催化三元体〔Ser、His和Asp〔天冬氨酸〕〕起主导作用，这三个氨基酸残基任何一种突变或修饰〔例如，Ser被DIPF修饰〕均可导致酶活性的丧失虽然各种丝氨酸蛋白酶具有高度的同源性，但构成催化三元体的三个氨基酸残基在肽链中的位置并不完全相同然而，酶学家已达成共识，将这三个氨基酸残基总是进行一样的编号，即His57、Asp102和Ser195它们在催化中的具体功能是：〔1〕Ser195充当进攻底物的亲核基团；〔2〕His57作为广义的酸碱催化剂；〔3〕Asp102 的功能仅仅是定向His57，影响His的 pKa，改变其酸碱性质。

胰蛋白酶具有很深的底物结合口袋，而口袋的底部又是Asp，特别适合长的碱性氨基酸侧链〔Lys赖和Arg精〕的结合；胰凝乳蛋白酶的底物结合口袋没有胰蛋白酶深，但比它宽，而且口袋壁分布的是疏水氨基酸，所以特别适合芳香族氨基酸的结合；弹性蛋白酶的底物结合口袋非常浅，最适合结合侧链较小的氨基酸残基糜蛋白酶的催化经历了酯酰化酶共价中间物，全部反响分五步：,1、底物和活性中心的Ser195和Gly〔甘〕193,,残基通过氢键形成ES复合物，疏水口袋正好能,,容纳芳香环2、亲核的Ser195残基进攻羰基碳，形成第一,,个四面体的过渡态中间物活性中心的三个氨基酸残基依次参与此阶段,,的反响,,糜蛋白酶催化的四,,面体中间物的形成,,糜蛋白酶催化形成的,,四面体中间物的稳定,3,、四面体中间物因肽氧负离子与,Ser195,以及,Gly193,之间形成氢键而稳定4,、肽键断裂，离开基团从,His57,咪唑环上得到一个质子原来肽键羧基一侧通过氢键以及与,Ser195,形成共价键仍与酶结合5,、水进入活性中心，质子化,His57,，使之成为酸释放出来的,OH,-,亲核进攻留下来的多肽羰基碳，第二个四面体形的过渡态中间物形成。

最后,Ser195,从,His57,重新获得质子，,His,仍然与它通过氢键相连，过渡态中间物瓦解，酯酰化酶中间物被水解天冬氨酸蛋白酶,活性中心涉及两个重要的Asp残基，他们交替充当广义的酸碱催化剂多数天冬氨酸蛋白酶都具有由两叶〔N端和C端各成一叶，每一叶相当一个结构域〕组成的三级结构，两叶呈两重对称属于这一蛋白酶家族的有胃蛋白酶，肾素、组织蛋白酶等在中性或偏酸条件下活性最高，与丝氨酸蛋白酶一样，在功能上要么是消化酶，要么是调节酶其催化机制为：,1、水和多肽底物进入两重对称的活性中心2、两个Asp残基的羧基具有不同的pKapKa高的Asp残基上羧基作为广义碱从水分子中抽取一个质子，产生的OH-亲核肽键上的羰基碳，形成氧负离子后者亲核进攻活性中心pKa低的Asp215残基上的羧基，夺取质子第二个Asp残基充当广义酸，为氧负离子提供质子，形成四面体状中间物3、Asp32和Asp215相互之间酸碱反响，质子从Asp32传到Asp2154、 Asp32和Asp215的酸碱催化导致四面体中间物拆分，产物释放，最后Asp32和Asp215再次进行质子交换，各自回到催化前状态酶活性的调节机制,,酶需要在正确的时间,,和正确的地点有正确活性,不适宜的表达或激活导致细胞的癌变或死亡！,,,,,,,,,,,,,,,,酶的“量变〞和“质变〞的比较,酶的“量变〞,改变酶量的方式有两种，一种是通过同工酶，另外一种是通过控制酶基因的表达和酶分子的降解。

同工酶,同工酶是指催化相同的反响但性质不同〔Vmax和/或Km不同〕的酶它们可能以不同的量出现在一种动物不同的组织或器官，也可能出现在任何真核生物细胞不同的细胞器例如，高等动物的乳酸脱氢酶〔LDH〕有五种形式—M4、M3H、M2H2、MH3和M4M4由四个M亚基组成，主要存在于骨骼肌，H4由四个H亚基组成，主要存在于心脏乳酸脱氢酶催化的酶促反响,酶的“质变〞,别构调节、共价修饰、水解激活、调节蛋白的结合和解离以及单体的聚合和解离酶活性的别构调节、共价修饰和水解激活调节的异同,别构调节,别构调节的原理在于一些酶除了活性中心以外，还含有所谓的别构中心，该中心能够结合一些特殊的配体分子〔有时为底物〕当别构中心结合配体以后，酶构象发生改变，从而影响到活性中心与底物的亲和力，并最终导致酶活性发生变化能够进行别构调节的酶称为别构酶，与别构中心结合调节酶活性的配体分子称为别构效应物起抑制作用的别构效应物称为别构抑制剂，起激活作用的别构效应物称为别构激活剂由底物作为别构效应物产生的别构效应称为同促效应，否那么，就称为异促效应许多别构酶具有多个别构中心，能够与不同的别构效应物结合具有协同效应的酶和无协同效应的酶都可以受到别构调节。

酶活性的反响抑制,别构调节最多出现在代谢途径中的反响抑制，它是指一条代谢途径〔通常是合成代谢途径〕的终产物作为别构抑制剂抑制代谢途径前面限速酶的活性，因此也被称为终产物抑制齐变学说解释别构效应物的作用机理,当别构效应物在别构中心与酶结合，诱导酶的设想发生变化，打破R态酶和T态酶之间的平衡如果是激活剂，那么更容易与R态酶结合，将平衡向左移动，使更多的酶转变为R态，最终产生激活的效果如果是抑制剂，那么更容易与T态酶结合，使平衡向右移动，使更多的酶变成T态，产生抑制效果酶活性的别构调节,激活物的存在意味着溶液中有更多的酶处于,R,态，这样就省掉了底物去诱发,T,态向,R,态转变，所以底物协同效应下降如果存在大量的激活剂，溶液中几乎所有的酶都处于,R,态，所以底物结合不再产生协同效应，于是速率和底物曲线变成了双曲线而抑制剂作用相反，导致溶液中更多的酶处于,T,态，需要更高浓度的底物去实现协同效应，,S,曲线更明显别构调节具有正协同效应的酶,,别构调节无协同效应的酶,酶的共价修饰调节,是指酶活性因其分子内的某些氨基酸残基发生共价修饰而发生变化的过程这种调节方式比别构调节要慢共价修饰的方式有：磷酸化、腺苷酸化、尿苷酸化、,ADP-,核糖基化和甲基化，其中磷酸化是最为常见的形式。

酶共价修饰的几种形式,,蛋白质的“可逆磷酸化〞,在蛋白质激酶催化下，许多酶上羟基氨基酸〔Ser〕丝氨酸、苏氨酸〔Thr〕、酪氨酸〔Tyr〕上的羟基接受ATP分子上的磷酸基团而被磷酸化修饰，被修饰的酶活性因构象变化发生改变是可逆的，在磷蛋白磷酸酶催化下，磷酸基团被水解，酶恢复原来状态水解激活,大多数蛋白酶以无活性的酶原形式被合成，需要通过水解〔由其它蛋白酶催化或自我催化〕去除一些氨基酸序列以后才会有活性，这种调节酶活性的方式被称为水解激活与共价修饰一样，水解激活也是一种全或无的调节方式，酶原状态没有活性，但与共价修饰不同的是，它是不可逆的，即一旦被激活就不可能回到原来的非活性的酶原状态胰蛋白酶的水解激活,调节蛋白的激活或抑制,某些蛋白质能够作为配体与特定的酶结合而调节被结合酶的活性，这些调节酶活性的蛋白质称为调节蛋白，其中，激活酶活性的调节蛋白称为激活蛋白，抑制酶活性的蛋白称为抑制蛋白抑制蛋白通常结合在酶的活性中心阻止底物与活性中心结合而到达抑制的效果抑制蛋白对酶活性的抑制,。