脂肪源干细胞修复兔膝关节全层软骨缺损研究.doc

1脂肪源干细胞修复兔膝关节全层软骨缺损研究【摘要】 观察评价兔膝关节髌股关节面中心人工制造全层关节软骨缺损后，单纯脂肪源干细胞复合海藻酸钙凝胶移植到软骨缺损处对关节全层软骨缺损的修复效果，以探索关节软骨缺损修复简单有效的途径 ［方法］新西兰大白兔 27 只随机分为 A、B、C 三组，A 组关节软骨缺损处置入海藻酸钙凝胶，B 组软骨缺损处不做任何处理，C 组缺损处置入未经诱导的脂肪源干细胞复合海藻酸钙凝胶，分别于术后第 4、8、12 周处死动物，通过大体、组织切片观察以及透射电镜等技术手段对修复效果进行观测，采用改良的 Wakitani 评分标准对修复组织进行评分，所得评分采用统计软件 SPSS 11.5 进行统计学分析 ［结果］A、B 组软骨缺损处为纤维组织状物填充，组织学切片可见为原纤维覆盖，C 组软骨缺损处为类透明软骨组织填充，组织切片可见类软骨细胞及其周围的陷窝，电镜下可见细胞周围大量胶原纤维，C 组在各个时期与 A 组、B 组的评分比较差异都具有统计学意义(P<0.01)，示 C 组修复效果较其他两组为优［结论］单纯脂肪源干细胞复合海藻酸钙凝胶可有效修复关节软骨全层缺损 【关键词】 脂肪源干细胞 海藻酸钙 软骨Abstract: ［Objective ］To evaluate the effect of not 2induced adipose derived stem cells(ADSCs)with calcium alginate healing full-thickness cartilage defects of rabbit knee after the model was made in center of femoral facies patellaris artificially, in order to find a simple and working way of articular cartilage defect restoration. ［Method］Twenty-seven New Zealand white rabbits were divided in to A, B, C groups randomly. Calcium alginate was transplanted to cartilage defect position of rabbits of group A, nothing for group B and calcium alginate with not induced ADSCs for group C. The animals were killed in 4th, 8th and 12th week later.Restored tissue was evaluated using naked eyes, histological section and transmission electron microscopy, score was given according to modified Wakitani grade standard. The total score was analyzed with statistic software SPSS 11.5. ［Result］Articular cartilage defects of the animal of groups A and B were filled with fibrous tissue which contains protofiber when it was checked using histological section and microscopy.The defect was filed with chondrocyte-like tissue .Chondrocyte-like cells surrounded with lacunes were observed in histological section. Plenty of collagen fibers around cells could be seen under transmission electron microscopy. Group C had a significant statistical 3difference compared with groups A and B (P<0.01) in each period which showed that group C got a better indication than other two groups.［Conclusion］Non-induced ADSCs with calcium alginate could repaire full-thickness cartilage defect of rabbit knee effectively.Key words：ADSCs; calcium alginate; cartilage关节软骨的自身修复能力有限，其损伤后的修复一直是骨科界的难题之一。

随着干细胞培养技术和组织工程技术的不断进步，多种组织工程方法被应用来探索软骨缺损治疗的可行性2001 年 Zuk PA 和 Zhu Min［1 ］等从人脂肪组织悬液中第一次分离获得了多向分化干细胞目前已证实脂肪组织来源干细胞（adipose derived stem cells,ADSCs）能向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌肉细胞及心肌细胞定向诱导分化［2］ 本实验将单纯脂肪源干细胞复合藻酸钙凝胶载体填充修复兔膝关节全层软骨缺损，对实验结果进行观察分析，以探讨单纯脂肪源干细胞应用于关节软骨缺损修复的可行性，为关节软骨缺损修复探索简单有效的途径1 材料和方法1.1 实验材料41.1.1 主要仪器(1)超净工作台 (JHT-DDC 型，济南康宝净化设备有限公司) ；(2)恒温孵育箱(Heraeus 公司，德国)；(3) 倒置相差显微镜(Nikon TE2000，日本)；(4)50 ml 培养瓶(Corning 公司，美国)；（5）低温高速离心机（Heraeus 公司，德国） 1.1.2 主要试剂(1)DMEM 培养基(Gibco 公司，美国) ； (2) Ⅰ型胶原酶(Sigma公司，美国)；(3) 胰蛋白酶(上海华美公司，中国)；(4)胎牛血清(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)；(5)D-Hank’s 平衡盐（Sigma 公司，美国） ；（6 ）海藻酸钠（上海化学试剂站分装厂） ；（7）氯化钙（上海生工生物工程有限公司） 。

2 实验方法2.1 脂肪源干细胞的获取、培养和鉴定将新西兰大白兔致死，无菌取双侧髂窝处脂肪组织约 10 ml，用2 倍体积 D-Hank’s 平衡盐液漂洗 3 遍，剪成 1 mm×1 mm×1 5mm 大小，加入 0.2%Ⅰ型胶原酶 5 ml 置于 37℃温箱内消化 0.5 h，低温高速离心机内 1 000 r/min 离心 10 min 弃上清，加入 160 mmol/L NH4Cl 约 5 ml 裂解红细胞 10 min，筛网过滤，按 8 000个/cm2 种植于 50 ml 培养瓶中培养瓶置于 37℃体积分数为 5%的 CO2 恒温孵育箱内 24 h 后首次换液，去除残余红细胞及未贴壁细胞，后每隔 2～3 d 换液一次，融合达 80%以上时传代，动物实验用细胞传至第 4 代取部分 2 代细胞采用含 10%FBS，0.1 μmol/L 地塞米松， 50 μmol/L 维生素 C，10 mmol/L β-甘油磷酸钠，100 U/ml 青霉素， 100 U/ml 链霉素的 DMEM 诱导培养基向成骨细胞方向诱导2.2 动物实验选择健康成年新西兰大白兔 27 只（购自山东鲁抗实验动物中心），体重 2.5～3.5 kg，雌雄不限。

编号后随机分成 A、B、C 3 组，每组 9 只，双膝均用于实验 10%水合氯醛耳缘静脉麻醉，取双侧膝关节内侧切口，将髌骨推向外侧，进入关节腔分别于左右两侧用直径 3.5 mm 的钻头在髌股关节面中心造成全厚关节软骨缺损，深度以点状出血为止，约 2.5 mmA 组：（18 膝）缺损处单纯置入海藻酸钙凝胶B 组：（18 膝） ，空白对照，缺损处不作任何处理C 组：（ 18 膝） ，置入培养的脂肪源干细胞／海藻酸钙凝胶复合物，细胞最终浓度不低于 2.0×106 ／ml术毕兔清醒后，放置6笼内自由活动，青霉素肌注连续 5 d2.3 检测方法2.3.1 细胞学检测生物学特性观察：观察细胞生长情况；取部分 2 代细胞制成细胞爬片做油红 O 染色；另取部分向成骨细胞方向诱导的 2 代细胞制成细胞爬片做 Von Kossa 染色观察矿化结节，以证实所培养细胞有无干细胞特性2.3.2 修复组织检测分别于术后 4、8、12 周处死动物，取材行大体、光镜组织学检查及电子显微镜下观察1)大体观察：膝关节滑膜有无充血水肿，关节囊有无粘连及修复组织的平整度、光泽度；(2)组织学检测：将标本脱钙、梯度酒精脱水，常规石蜡包埋、切片，HE 染色和甲苯胺兰染色，进行光镜下组织学观察；（3）透射电镜观察：取 12 周修复组织，包埋后超薄切片，观察细胞及基质情况。

2.4 统计学分析7根据改良的 Wakitani 评分标准( 见表 1)采用盲法对各标本进行组织学评分每一标本均有 3 人进行评分，取均数，所得评分结果应用 SPSS 11.5 统计软件进行多因素方差分析，与对照组比较采用Dunnett 检验表 1 软骨缺损修复的组织学评分标准指标组织学表现评分3 结果3.1 脂肪源干细胞培养及诱导细胞于接种后 24 h 左右开始贴壁，细胞形态呈长梭形、三角形或多角形（图 1） 细胞生长旺盛， 3～4 d 即可传代取部分 2 代细胞制成细胞爬片做油红 O 染色，苏木素复染细胞核，胞质未被油红 O 着色（图 2） ，可见胞质中不含脂质，与脂肪谱系细胞无相关性细胞培养 7 代后仍然增殖旺盛向成骨细胞方向诱导的 2 代细胞制成细胞爬片做 Von Kossa 染色，可观察到形成的矿化结节有 Ag+沉积而呈黑色（见图 3） ，说明所培养的脂肪源干细胞有向成骨细胞分化的能力，有潜在的分化特性，具有干细胞特征3.2 大体观察术后 3～4 d 动物轻度跛行，1 周左右恢复正常膝关节无红、肿、热等炎症现象处死动物后见关节液清亮，关节囊无挛缩、粘8连和新生物形成，滑膜无充血水肿，软骨无侵蚀，关节边缘无骨赘形成。

术后 4 周，A、B 组缺损处修复组织基本相同，缺损处未完全填充，修复组织为灰白色，基底部呈深红色，未见明显的炎性肉芽组织；C 组缺损处亦未完全填充，但修复组织呈黄白色外观，表面粗糙；呈连绵的小丘状，与周围关节软骨分界清楚术后 8 周，A、B 组缺损处修复组织仍基本相同，缺损处未完全填充，但较前为多，修复组织仍为灰白色，表面粗糙，C 组缺损处未完全填充，修复组织亦较以前为多，淡黄白色，表面变的光滑，有一定弹性，与周围正常软骨分界仍能辨认术后第 12 周，A、B 组缺损多完全填充，基本为纤维组织状物覆盖，表面与正常软骨齐平，深灰白色，质软，与周围正常软骨组织分界清楚，易剥离；C 组缺损区修复组织色泽、质地同正常关节软骨，表面光滑，与周围软骨组织界面平齐并完全整合，结合紧密，不易剥离，与周围正常软骨组织界限模糊（图 4） 3.3 组织学观察术后 4 周，A、B 组见缺损区凹陷，有血凝块，被覆纤维组织，9甲苯胺兰染色呈无异染性着色的纤维组织；C 组见少量增殖的类似幼稚软骨细胞的细胞和较少的基质，细胞排列稍紊乱、不规则，细胞形态较小，周围无典型的陷窝样结构，甲苯胺兰染色异染性不明显，未见。