IL12重组载体的抗肿瘤作用.doc

1IL12 重组载体的抗肿瘤作用【关键词】 白细胞介素 12 遗传载体 抗肿瘤药 综述 细胞因子疗法为临床治疗肿瘤提供了一种安全可行的方法，在目前肿瘤治疗中占有一定地位，已经展示出良好的应用前景在目前发现的细胞因子中，白细胞介素 12（ IL 12）是对体内免疫活性细胞诱导和调节作用最强、范围最广的一种细胞因子，是最有效的抗肿瘤细胞因子之一由于直接注射 IL 12 的副作用，介导IL 12 基因转移进行肿瘤基因治疗是近年的研究热点近年来，其重组载体被越来越多地应用于临床，使它的作用更好地得到了发挥本文就 IL 12 的分子结构特征、生物学功能、抗肿瘤作用及 IL 12重组载体应用的研究作一综述 1 IL 12 的分子结构特征 IL 12 主要是由单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞产生的一种异二聚体细胞因子，永生化的 B 细胞、CD4+ 细胞、中性粒细胞和肥大细胞等也可产生 IL 12[1]IL 12 组成的两个亚基 P40 和 P35 分别由两个基因编码，单独的 P40 和 P35 亚基均不能与 IL 12 受体结合P35 在体内普遍表达，而 P40 的表达受各种刺激因素的调控，只有两个基因共同表达才能组成有活性的IL 12，游离的 P40 的二聚体蛋白是 IL 12 的天然抑制物。

所以，在 IL 12 的基因治疗中，近年来一般将 P35 和 P40 融合连接成单2链基因片段，以保证二者的均衡表达IL 12 有种族特异性，人IL 12 在鼠中活性很小，鼠 IL 12 在人中则有活性，人与鼠 IL 12亚基氨基酸序列的比较显示，P40 亚基比 P35 亚基具有更高的保守性，P40 亚基序列一致性为 70%，相似性为 79%；P35 亚基序列一致性为 60%，相似性为 71%[2] 2 IL 12 的生物学功能 2.1 IL 12 对 T 细胞和 NK 细胞的作用 IL 12 可明显刺激静止或激活的外周血 T 细胞、NK 细胞分泌 IFN γ，IFN γ 与 IL 12 有协同作用，但对于静止的细胞需要辅助细胞的参与IL 12 一方面能诱导 T 细胞和 NK 细胞产生多种细胞因子，促进细胞毒性淋巴细胞增殖和功能的活化；另一方面在和肿瘤抗原的共刺激下，还能诱导特异性杀伤性 T 细胞（CTL）的产生，该细胞被认为是杀瘤作用最强的细胞已发现 IL 12 能促进穿孔素和颗粒酶的表达，增加胞浆内颗粒的产生，上调细胞表面表达多种黏附分子和细胞因子受体[3] 2.2 IL 12 对 Th1/Th2 的调节 IL 12 促进 Th 细胞向 Th1 细胞分化，不但直接作用于 Th1细胞和其前体并产生Ⅰ型细胞因子，如 IL 2、IFN γ 和淋巴毒素（LT）等，还可以在肿瘤坏死因子 (TNF α)和 IL 1 协同作用下间接通过 T 细胞和 NK 细胞产生 TNF γ 而实现 [4]。

在人和鼠，已证明3IL 12 是 Th1 产生的必需因子，能诱导早期辅助性 T 细胞分化为Th1，并促进 Th1 的增殖在体外当用过敏原作用于 CD4+细胞时，导致其生成 Th2 型细胞；当有 IL 12 存在时，则生成 Th1 型细胞，分泌 IFN γ 而不分泌 IL 4因此，IL 12 和 IL 4 作用于 CD4+细胞分别支持 Th1 和 Th2 细胞的分化[5] 3 IL 12 的抗肿瘤作用 大量动物实验和临床研究表明，IL 12 能够明显抑制肿瘤的生长和转移，延长荷瘤动物的生存时间但对 IL 12 抗肿瘤作用及其在不同肿瘤中的作用机制各家报道不同 3.1 IL 12 介导的 T 细胞参与抗肿瘤作用 IL 12 不仅可抑制新生肿瘤的生长，而且还可使已存在的肿瘤消退，且其抗瘤活性依赖于剂量KNUTSON 等在 HER2/neu 抗原提呈 T 细胞的体外研究中发现，IL 12 以量效依赖的方式恢复抗原提呈的增殖p776 790 特异性 T 细胞在 IL 12 和 IL 2 刺激后更加容易与抗原发生反应，从而发生增殖反应和分泌细胞因子(IFN γ 和 TNF α)，这些结果都提示 IL 12 在体外恢复和保持抗原提呈 CD4+T 细胞中发挥着重要的作用。

同时也为 CD4+T 细胞在肿瘤过继治疗中的应用提供了理论依据[6]利用重组卡介苗和鼠IL 12 增加 Th1 型细胞因子(包括 IFN γ 和 IL 12)的分泌，诱导瘤内 CD4+/CD8+T 细胞和 NK 细胞的浸润，从而可抑制 C3H/HeN4小鼠体内肿瘤的增殖这种抗肿瘤的效应与 Th1 淋巴细胞和 NK 细胞介导的细胞毒性免疫反应相关[7] 3.2 IL 12 通过提高 NK 细胞活性的抗肿瘤作用 在体外，IL 12 可明显增加人外周淋巴细胞 (PBMC)和 NK细胞的活性可纠正各种实体肿瘤病人的 PBMC 中 NK 细胞活性缺陷，在这些病人中用 IL 12 协同 IL 2，可增加对 NK 细胞敏感的和不敏感的肿瘤细胞的细胞毒作用在抗体包被的肿瘤细胞和 IL 12的双重刺激下，NK 细胞可分泌不同效能的免疫刺激细胞因子 [8] 3.3 IL 12 分泌 IFN γ 参与抗肿瘤作用 IL 12 抗肿瘤作用在很大程度上是由继发分泌的 IFN γ 所决定的单独应用 IFN γ 并不能产生抗肿瘤作用，说明虽然 IFN γ的产生对于 IL 12 的抗肿瘤作用是必需的，但是必须有 IL 12 的存在。

IFN γ 涉及多种抗瘤机制，包括 IFN γ 与 TNF β 相关的直接的细胞毒作用，以及诱导细胞慢性增殖，诱导 NO 产生，抑制血管生成等重组人类 IL 12 可刺激 CD4+和 CD8+T 细胞分泌IFN γ，血清 IFN γ 的水平与抑瘤作用直接相关细胞凋亡的研究表明，IL 12 诱导的抗肿瘤机制与 CD4+T 细胞有关系[9] 3.4 IL 12 与抑制血管生成 已经证明 IL 12 在体内有抗血管形成作用，研究表明，5IL 12 不是直接作用于血管内皮细胞，而是通过诱导 IFN γ 的产生，后者可能通过诱导 CXC 趋化因子以及干扰素诱生蛋白 10（IP 10 ） ，从而抑制血管生成，此种抗肿瘤血管生成的作用有助于抑制肿瘤的生长和转移[10] IL 12 刺激 NK 细胞分泌 IFN γ，IFN γ 又刺激周围组织中的内皮细胞分泌 IP 10，IP 10 可趋化 NK、单核、巨噬细胞向反应部位聚集一旦 NK 细胞被激活，将表现出强大的细胞溶解和杀伤邻近组织中的内皮细胞作用，抑制新生血管生成IP 10 是一个重要的化学因子，在体内有抑制血管生成和抗肿瘤作用[11]通过这一作用可抑制去除免疫细胞和 NK 细胞 SCID 鼠的癌的生长[12] 。

3.5 IL 12 诱导巨噬细胞、中性粒细胞等参与抗肿瘤作用 巨噬细胞被认为是抗恶性肿瘤的一种重要细胞，它通过产生TNF β 和 NO 而起作用IL 12 能够显著增加肺癌病人胸腔和外周血单核巨噬细胞的杀伤活性，利用 IL 12 孵育的胸腔单核巨噬细胞比外周血单核巨噬细胞能产生更多的 IFN γ 和 IL 10[13] 3.6 IL 12 与肿瘤微环境 人类肿瘤微环境包括肿瘤细胞、炎症反应细胞、成纤维细胞、内皮细胞等混合物，它可归于细胞外基质的范畴很难研究这些细胞在肿瘤发生时相互间的作用及动态变化有实验表明，异体移植肿瘤中的炎性细胞可抑制肿瘤的生长，而这一作用被认为是由6IL 12 所介导的[14] 4 IL 12 重组载体抗肿瘤治疗的应用 目前已证明 IL 12 对 20 余种肿瘤有较好疗效，对肺肿瘤、淋巴肿瘤作用较好但是其全身的副作用和半衰期短的缺点大大限制了其临床应用人们利用分子生物学技术将其导入质粒或腺病毒的载体中，并使之稳定有效表达，从而克服上述缺点 全身或肿瘤局部应用重组的 IL 12 使肿瘤萎缩消退，例如，在宫颈癌 IL 12 Ⅰ期临床试验中发现，IL 12 的治疗与改善与人类乳头瘤状病毒 (HPV)蛋白 16 中 E4、E6 和 E7 肽段的淋巴组织增殖效应有关。

但是一些研究发现，IL 12 达到一定的剂量(1 μg/d)才能较好地发挥作用，这种疗法容易引起脾大等副作用[8] 4.1 IL 12 重组载体的类型 4.1.1 病毒载体 目前病毒载体是基因治疗领域中最常采用的转基因载体，应用各种病毒载体已经成功地将 IL 12 基因导入肿瘤局部并获得表达，显示出良好的抗瘤效应在基因治疗中应用最多的逆转录病毒载体为内启动子载体，但由于启动子之间存在相互干扰，难以同时表达多个基因，为了得到能协同表达多个基因的逆转录病毒载体，人们利用微小病毒 5′端非翻译区具有内核糖体进入位点的功能(IRES)构建了多顺反子逆转录病毒载体核糖体，能与 IRES相结合，以帽非依赖方式翻译其下游基因 以无菌方式瘤内注射给予 advhIL 12，自给药之日起，每 3 d 测量瘤体大小，并记录各组7动物死亡情况，结果表明具有抗肿瘤作用[6～7] GRI 等[9]将IL 12cDNA 以逆转录病毒载体介导转移鼠肉瘤细胞，重新接种于鼠体，结果发现其致瘤性消失，并且激发机体的免疫应答，引起其他部位野生型肿瘤的消退进一步研究表明，早期的抗瘤反应由NK 细胞和 IFN γ 介导，而后期抗瘤免疫力的维持则由 T 细胞介导，随后将 IL 12 转染的 NIH3T3 细胞与鼠黑色素瘤 BL26 细胞混合培养，提示 IL 12 可通过旁分泌方式抑制肿瘤的生长。

但这种载体应用于人体的缺陷是不能感染非分裂细胞[7] 4.1.2 重组腺伴随病毒载体 Ⅱ型腺伴随病毒(AAV 2) 具有对人体不致病，能感染分裂和非分裂细胞等优点，在此基础上经过改造得到的重组腺伴随病毒(rAAV)载体是一种比较理想的基因转移载体，抗瘤效应明显优于其他细胞因子目前制备多用细胞内同源重组法，有研究选用细菌内同源重组法制备含构建 mIL 12 基因的重组腺病毒载体，从而从根本上克服了细胞内同源重组法的种种缺陷SEGAL 等[8] 将 mIL 12 cDNA 以重组腺病毒为载体，瘤内直接注射，发现可显著抑制肿瘤生长以及促进肿瘤转移灶明显消退，显著延长存活时间，而且激发了机体持久的免疫力组织学观察，肿瘤组织纤维化并伴有严重的炎症反应，瘤组织内浸润的细胞主要为淋巴细胞以及一些巨噬细胞和中性粒细胞腺病毒载体的缺陷是容易诱发机体产生免疫反应[7] 4.1.3 其他的病毒载体 其他的病毒载体系统如腺相关病毒载体(AAV)以及重组鸟痘病毒载体(ALVAC)介导的 IL 12 基因治疗方8案亦显示出良好的疗效尤其是 ALVAC 载体，由于其感染宿主范围广，高效表达外源基因，不在哺乳动物细胞内复制，更不会整合于宿主细胞，因而可以安全地用于人体。

另外，由于 ALVAC/IL 12不能整合于宿主基因组中，一次注射，IL 12 在局部的表达仅能维持有限的时间，因而需要反复瘤内注射[8] RAKHMILEVICH 等将载有 IL 12 DNA 的质粒用基因枪轰击肿瘤生长部位，引起肿瘤消退在致瘤后每 3 或 4 d 注射一次，剂量为每次 50 μg，注射 5～6 次后测各种指标这种方法的优点是：所携带的 IL 12 基因能较长时间的表达(15～30 d);与其他方法相比基本没有副作用;所引起的 NK 细胞活性较其他方法高 3～4 倍不足的是 IL 12 表达的量较其他方法低一些，但这种方法安全有效，简便，而且适用范围广泛，有望得到进一步完善直接瘤内注射质粒DNA，一方面可避免载体本身病毒蛋白诱发局部免疫反应对病毒载体的清除；而瘤内注射表达细胞因子的质粒 DNA，既可提高病灶局部细胞因子相对浓度，又可降低细胞因子引起的全身副作用，从而产生更好的抗肿瘤效应质粒载体一般为 5.0～7.0 kb 4.2 将编码 IL 12 的 DNA 克隆入放射处理。