微生物限度检查作业指导书样本.doc

目：建立微生物限度检查原则操作规程，为微生物检查人员提供对的操作办法范畴：合用于辅料、内包材料和所有产品微生物限度检查职责：检查人员对本规程实行负责参照原则：GB/T4789.3-,GB/T4789.15-,GB/T4789.2-内容：1 概述微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染限度一种检查办法，涉及染菌量及控制菌检查供试品普通按批号随机抽样；抽样量应为检查用量（2个以上最小包装单位）3倍量（以备复检）检查全过程，均应严格遵守无菌操作，严防再污染2 仪器与用品恒温恒湿培养箱、生化培养箱、恒温水浴、高压蒸汽消毒锅、电热恒温干燥箱；试管、锥形瓶、量筒、培养皿（Φ90mm）、刻度吸管、研钵；托盘天平或电子天平、镊子、剪刀、酒精灯、打火机、编号笔、75%酒精棉球；拖鞋、无菌衣、裤、帽、口罩以上玻璃器皿、镊子、剪刀等洗净、晾干，160～170℃干烤2h，备用所有灭菌物品存储于第一缓冲间，不应超过2周即用毕否则，应重新灭菌3 培养基、试液配制营养琼脂培养基（细菌用）、孟加拉红培养基（虎红琼脂培养基，霉菌用）， 胆盐乳糖培养基（即BL，用于大肠杆菌增菌培养）、4—甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG）培养基（用于大肠杆菌迅速检查）、麦康凯琼脂培养基（即MacC，用于肠道菌分离培养）、蛋白胨水培养基（供靛基质实验用）、磷酸盐葡萄糖胨水培养基（供甲基红及VP实验用）、枸橼酸盐培养基（供枸橼酸盐运用实验用）；营养肉汤培养基、四硫磺酸钠亮绿培养基（TTB，沙门菌增菌用）、胆盐硫乳琼脂（DHL）或沙门、志贺菌属琼脂（SS）培养基（用于沙门菌分离培养）、麦康凯琼脂或曙红亚甲蓝琼脂培养基（大肠杆菌及沙门菌分离培养用）、三糖铁琼脂（TSI）斜面培养基（肠道菌初步鉴别用）配制及灭菌办法参见中华人民共和国药典一部附录ⅩⅢC。

0.1%2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液（供制备培养基用）、氢氧化钾试液（供作V–P反映试剂）、α–萘酚乙醇溶液（供作V―P试剂）、靛基质试液配制及灭菌办法参见中华人民共和国药典一部附录ⅩⅢC 稀释剂：0.9%无菌氯化钠溶液、无菌磷酸盐缓冲液（PH7.2）4 操作过程4.1 实验前准备4.1.1 将所有已灭菌培养皿、锥形瓶、研钵、试管、吸管、量筒、稀释剂及供试品等通过传递窗进入无菌室内，每次实验所用物品必要事先筹划，准备足够用量，避免操作中出入将所有包装去掉，编号4.1.2 启动紫外灯30分钟（或臭氧发生器1h）和空气过滤装置30分钟，进行空间灭菌解决4.1.3 操作人员用肥皂洗手，关闭紫外线杀菌灯（或臭氧发生器），进入缓冲间，换工作鞋再用0.1%苯扎溴铵（新洁尔灭）消毒液洗手或乙醇棉球擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套4.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手，再用乙醇棉球（或碘伏棉球）擦拭供试品瓶、盒、袋等开口处周边，待干后用灭菌手术剪刀将供试品瓶、盒、袋启封启封后先检查包装内侧及周边有无生霉、长螨迹象，若经证明为生霉、长螨即可判为不合格，不必继续检查4.1.5 定期检查无菌环境空气与否符合规定。

4.2 操作4.2.1 细菌、霉菌与酵母菌4.2.1.1 以无菌操作，称取检样25g(ml)，加入含225ml灭菌水具玻塞锥形瓶中，振摇30min,即为1：10稀释液 4.2.1.2 用灭菌吸管吸取1：10稀释液10ml，注入灭菌试管中，另用1ml灭菌吸管重复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开4.2.1.3 取1支1ml灭菌吸管吸取1：10均匀供试液1ml，沿管壁加入装有9ml灭菌稀释剂试管中，混匀即1：100供试液以此类推，依照供试品污染限度，可稀释至1：103或1：104，细菌选取两至三个稀释度，霉菌选取三个稀释度4.2.1.4 在进行10倍递增稀释同步，以该稀释级吸管吸取每级稀释液各1ml置每个灭菌平皿中，每稀释级注2个平皿另取1支1ml吸管吸取稀释剂各1ml注入2个平皿中，作为阴性对照4.2.1.5 将融化并冷至约45℃培养基注入上述各个平皿约15 ml，以顺时针或反时针方向迅速转动平皿（勿使培养基溢出）使供试液与培养基混匀，放置，待凝4.2.1.6 将已凝固平板倒置于适当温度培养箱中，培养细菌于36℃±1℃培养48±2小时，霉菌、酵母菌于25～28℃培养，3天后开始观测，共培养观测5天。

4.2.1.7 将平板置菌落计数器上或从平板背面直接以肉眼用标记笔点计，以透视光衬以暗色背景，仔细观测，计数4.2.2 大肠杆菌取胆盐乳糖培养基3份，每份100ml，2份分别加入规定量供试液，其中1份加入对照菌50～100个作阳性对照，第3份加入与供试液等量稀释液作阴性对照培养18～24小时（必要可延至48小时）阴性对照应无菌生长取上述3份培养物各0.2ml，分别接种至5ml MUG培养基管内培养，分别于5小时与24小时时，取未接种MUG培养基管作本底对照，将各管置365nm紫外光下观测阳性对照管呈现荧光，MUG阳性供试液MUG管呈现荧光，MUG阳性：无荧光，MUG阴性然后加数滴靛基质试液于MUG管内，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性当阴性对照呈阴性，阳性对照正常生长，供试液胆盐乳糖培养基培养液澄明，并证明无菌生长，判未检出大肠杆菌供试液MUG阳性，靛基质阳性，判检出大肠杆菌；MUG阴性，靛基质阴性，判未检出大肠杆菌如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，均应取供试液胆盐乳糖培养基培养物划线于曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板，培养18~24小时，如上述供试液培养物分离平板无菌落生长，判未检出大肠杆菌。

或有菌落生长，应挑选2~3可疑菌落作靛基质实验（Ⅰ）、甲基红实验（M）、乙酰甲基甲醇生成实验（V-P）、枸橼酸盐运用实验（C）及革兰染色、镜检，按下表判断成果MUG—I曙红亚甲蓝琼脂IMVic成果+ +检出大肠杆菌－ －未检出大肠杆菌+ －无菌生长未检出大肠杆菌+ －有菌生长－ + － －①检出大肠杆菌③－ +有菌生长+ + － －②检出大肠杆菌③注：①②——如①浮现++－－或②浮现－+－－，均应重新分离菌株，再作MUG-I 和IMVic实验 ③革兰氏阴性杆菌4.2.3 沙门菌：取营养肉汤培养基3份，每份100ml，2份分别加入规定量供试液，其中1份加入对照菌液作阳性对照，第3份加入与供试液等量稀释液作阴性对照培养18～24小时，阴性对照应无菌生长取别的2份培养物各1 ml，分别接种于四硫磺酸钠亮绿培养基10 ml中，培养18～24小时分别划线接种于胆盐硫乳琼脂（或沙门、志贺菌属琼脂）培养基和麦康凯琼脂（或曙红亚甲蓝琼脂）培养基平板上，培养18～24小时或延至40～48小时当阳性对照平板呈现阳性菌落时，供试品平板无菌落生长，或有菌落但不同于下表所列特性时，可判为未检出沙门菌。

培养基菌 落 形 态胆盐硫乳琼脂无色至浅橙色，半透明，菌落中心带黑色或全黑色或无色沙门、志贺菌属琼脂无色至淡红色，半透明或不透明，菌落中心有时带黑褐色曙红亚甲蓝琼脂无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润圆形菌落麦康凯琼脂无色至浅橙色，透明或半透明，菌落中心有时为暗色如供试品平板生长菌落特性有与上表所列形态特性相符或疑似者，均应挑选2～3个菌落分别接种于三糖铁琼脂培养基斜面上，阳性对照同步接种该培养基，培养18～24小时后，阳性对照斜面应为红色，底层为黄色，硫化氢阳性，而供试品疑似菌斜面未见红色、底层未见黄色，可判为未检出沙门菌否则，应继续做靛基质实验、脲酶实验、赖氨酸脱羧酶实验、动力检查、血清凝集实验5 注意事项5.1 供试品在检查之前，应保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件不当引起致死，损伤或繁殖供试品在检查之前，应保持原包装状态，禁止启动包装已启动样品不得作为供试品5.2 除另有规定外，供试品制备成供试液后，应在均匀状态取样制成供试液后，应在60分钟内注皿操作完毕5.3 配制后培养基应及时灭菌，避免细菌繁殖培养基不应有沉淀，如发生沉淀，应趁热过滤5.4 制备妥培养基应在冷暗处保存，放置时间不能过长，锥形瓶琼脂培养基保存时间最长不能超过一种月，以免水分散失染菌。

5.5 勿用电炉直接融化琼脂培养基，以免营养成分过度受热而破坏5.6 注皿时培养基应在45±1℃，高于45℃时易导致细菌受损或致死，低于45℃时易凝固，因而使用前应水浴保温5.7 细菌、霉菌与酵母菌及控制菌必要做阴性对照实验（目：测试检查全过程无菌技术可靠性），控制菌必要做阳性对照实验（目：检查供试品与否对控制菌生长产生干扰作用，同步检查培养条件与否适当）5.8 阳性对照实验操作必要与供试品检查操作严格分开，避免交叉污染5.9 做完实验后，用消毒液清洁，开紫外灯照射30分钟（或臭氧发生器1h）6 成果鉴定菌数报告及成果鉴定按中华人民共和国药典二部附录ⅩⅢC附件1 霉菌与酵母菌检查程序附件2 细菌检查程序附件3 大肠杆菌检查程序供试品 供试液 。