克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用ppt课件.ppt

克隆性基因重排在淋巴瘤诊断中的运用克隆性基因重排在淋巴瘤诊断中的运用Clinically Suspicious LNBiopsyMorphology with IHCIf necessary,Molecular DxCytogenetics/FISHEvaluation of the Suspicious Lymph NodeCarcinoma v. LymphomaFNAWith Flow Cytometry Suspect LymphomaCarcinomaCLLSuspect Lymphoma,Negative orNon-diagnosticWorkup for PrimaryDiagnosisStaging and TreatmentFISHTreatmentNCCN NHL Lymphoma Guidelines〔〔5-10%〕〕分子和细胞遗传学异常分子和细胞遗传学异常•抗原受体基因的克隆性重排抗原受体基因的克隆性重排•与类型相关的染色体异常与类型相关的染色体异常l简要原理简要原理l检测方法检测方法l运用和战略运用和战略l本卷须知本卷须知淋巴细胞外表受体淋巴细胞外表受体lIG：： IGH 〔 〔14q32)l IGL  (2q12)l   (22q11)lTCR: l TCRα 14q11l TCRβ 7q32l TCRγ 7p15 l TCRδ 14q11.2l l IG和和TCR基因构造及重排过程基因构造及重排过程胚系可变区恒定区胚系D-J重排V-D-J重排转录与拼接各区片段数多各区片段数多 重排的多样性重排的多样性 抗体多样性抗体多样性 IGH IGKIGLTCRATCRBTCRGTCRDV V664338464768D D277656546798J J655611354淋巴细胞发育过程中基因重排顺序淋巴细胞发育过程中基因重排顺序•IG: H重排κ: IgH/κ • κ缺失 λ： IgH/λ •　　　• TCR: ：TCR•　　　 ：TCR  淋巴瘤中基因重排方式淋巴瘤中基因重排方式——克隆性重排克隆性重排不同的淋巴细胞一样的重排方式淋巴细胞单克隆性增生 淋巴瘤诊断和鉴别诊断的分子目的 克隆性重排的检测方法克隆性重排的检测方法•Southern 杂交•PCR法特异性探针： 胚系的特征性片段外 另一不同大小的片段Southern 杂交•优点： 敏感性较高• 可靠性高•缺陷： DNA量多〔10ug)• 新颖组织• 操作复杂• 时间长、本钱高• 放射性同位素•　逐渐被PCR方法替代．• • PCR法 原理原理: VDJ重排重排 后相互靠后相互靠拢拢，用适当的引物可，用适当的引物可扩扩增增出重排片段出重排片段新颖、冻存、石蜡、显微切割或细胞学标本，不受DNA片段的影响，仅需求少量的DNA，时间短，敏感性高，是目前最常用的克隆性重排的检测方法。

引物的选择原那么引物的选择原那么l引物位置：PCR产物长度<300bp (最好在100－300bp〕l 离衔接区的间隔>10-15bpl引物本身的长度<25bpl准确地将一切VDJ基因片段捡出l家族性引物或通用引物l不同的组合具有互补性，提高阳性率l引物数目和同源性之间平衡 该协作研讨由47个研讨所组成7个网络和一个病理panel它由分子生物学、免疫学、血液学、病理学等领域的专家2019.6-2019.7， 12次国际性会议主要目的： 〔1〕开发和规范化PCR实验操作和PCR引物 〔2〕 评价和运用该规范化方法BMH4－－CT983936的欧洲的欧洲BIOMED－－2 协作研讨协作研讨设计了一套完好的引物和方法用于IG和TCR基因重排的克隆性分析，共有14管97对引物IGH〔A,B,C,D,E 5管〕IGK〔A，B 2管〕IGL〔1管〕TCRB〔A，B，C 3管〕TCRG〔A，B 2管〕TCRD(1 管) Van Dongen JJM et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the Biomed-2 concerted action BMH4-C98-3936 Leukemia 2019;17:2257-2317一切引物采用一样的扩增条件和检测方法，并具有很高的敏感性和特异性，已被引荐为可疑淋巴组织增生性疾病克隆性分析的规范方法，试剂已商品化invivoscribe/PCR产物分析方法产物分析方法克隆性重排判别根本原那么：条带在期望的碱基大小范围内；一条或两条带宽不超越1mm,边缘整齐；多克隆性： 无特异性条带，弥散带或梯状带1.聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳(PAGE)-异源双链分析异源双链分析+-2. 毛细管电泳基因扫描〔毛细管电泳基因扫描〔genescan〕〕单克隆性细胞产生一个或两个尖的峰，多克隆为多个小峰，呈Gaussian分布。

〔本课题组曾用两种方法分析180管皮肤淋巴瘤的TCR基因重排，两者的符合率为96.7%, 在TCRB用genescan方法稍敏感，在TCRD用PAGE更特异〕对照的设立对照的设立•阳性对照•阴性对照•内对照:• 3个病例的内对照b-actin均为阳性- + - + - + - + - + - +FR2 FR3A TCRG1 TCRG2 TCRB1 TCRB2 对照的设立对照的设立－＋－＋－＋－＋－＋－＋2019-01-04 control and 1克隆性基因重排的运用克隆性基因重排的运用诊断与鉴别诊断谱系确定分期克隆相关性判别 〔1〕形状和IHC不能得出一定结论的淋巴组织增生性病变 胃肠道、肺、涎腺、甲状腺、眼眶等部位的MALT淋巴瘤 滤泡性淋巴瘤、皮肤淋巴瘤和T细胞淋巴瘤 形状不典型，缺乏特异性标志CP2170, 66M, 胃黏膜活检CP2171, 43F, 左腮腺肿块明显的浆样分化细胞 - + - + - +CP2170 ： FR1 (+), FR2(+), FR3(+)诊断： 〔胃〕小B细胞淋巴瘤，倾向MALT边缘区B细胞淋巴瘤CP2171： FR1 (+), FR2(+), FR3(-)诊断：〔左腮腺〕符合MALT边缘区B细胞淋巴瘤〔2〕 形状和免疫组化均可思索为淋巴瘤 但部位少见或发病年龄不典型 基因重排克隆性分析可添加诊断的根据54M, 舌跟部肿块， PTCL1M, 左颈鸡蛋大肿块, PTCL?17 F, 右颈部淋巴结 FL38M, 左颈部淋巴结 AILT17F, 右颈淋巴结肿大右颈淋巴结肿大内 FR1 FR2 FR3 - + - + - + - +CD20Bcl-23. 组织小或无法获得组织病变的诊断组织小或无法获得组织病变的诊断•深部肿块的穿刺或活检标本如胃镜标本•无明显肿块，仅表现为胸腹水• 但要特别留意细胞的量52M ， 左眼内汲取物细胞涂片检查：见恶性肿瘤细胞，小圆细胞肿瘤，倾向淋巴瘤基因重排：FR1(+), FR2(+), FR3(-)(4) 淋巴瘤谱系的判别 T or (富于T) B? T or NK/T? , T or γδ-T ? 34M, 右面部肿胀5月，CD56-, TIA+, PE+, EBER+, TCRr (-), TCRb (-) 内内 γ 1 γ2 β1β2TCRγ(-)TCRβ(-)CD56EBER(5〕 比较两个淋巴瘤克隆性的相关性， 或区别复发和第二原发肿瘤。

组织细胞/树突细胞肉瘤- ALL, T淋母 ( 6〕 外周血和骨髓累及情况 胃DLBCL外周血胃DLBCL，要求察看外周血累及情况MRD理想的检测方法：理想的检测方法： 活检组织的活检组织的PCR产物克隆，产物克隆， 对衔接区进展测序，对衔接区进展测序， 再设计病人特异的引物做再设计病人特异的引物做real-PCR进展进展MRD的评价的评价运用战略运用战略• 采用一切引物组，任务量大，不适用，没有必要， 有交叉和重叠•合理的运用战略——以最少的引物组最大能够地检测克隆性Suspected B-cell ProliferationsSuspected Lymphoid Proliferations of unknown origin (B or T) Suspected T-cell Proliferations TCRγδ+ Proliferations or immature T-cell IGH (VH-JH)IGKPreferably with No clonalitybut still suspected IGH (DH-JH)Preferably withIGL Clonal (generally multiiple Clonal results) Clonal No evidence of clonalityTCRBPreferably withTCRGTCRGTCRDandResults should be considered in the context of all available clinical, histological and immunophenotypic dataVan Krieken, et al. Leukemia 2019;21:201-206Suspected B-cell ProliferationsSuspected Lymphoid Proliferations of unknown origin (B or T) Suspected T-cell Proliferations IGHB+IGKA+BPreferably withNo evidence 0f presence of clonal B/T population in the sameleIGHB+IGKA+BIGHA+C+DIGL+IGHETCRGA+BTCRBA+BTCRBA+B+CTCRBc +TCRDTCRBC+TCRDTCRαβ TCRγδIf not clonalIf not clonalIf not clonalLiu et al. British J Haematol 2019;：：31-43Lineage unknown1. 1. 克隆性不等于恶性：克隆性不等于恶性： 有些良性病变有时也有克隆性重排有些良性病变有时也有克隆性重排　　CD8+CD8+〔有时〔有时CD4+) T CD4+) T 细胞增生症细胞增生症　良性单克隆性　良性单克隆性r r球蛋白病球蛋白病　　EBVEBV阳性的淋巴细胞增生阳性的淋巴细胞增生 〔〔AILT)AILT) 本身免疫性疾病本身免疫性疾病(Sjogren (Sjogren 综合症综合症, ,风湿性关节炎风湿性关节炎) ) 免疫缺陷形状免疫缺陷形状( (先天性先天性, ,移植后移植后,HIV,HIV感染感染) ) 免疫调理异常疾病〔免疫调理异常疾病〔Castleman Castleman 病〕病〕 皮肤异常病变〔淋巴瘤样丘疹病，急性苔藓样糠皮肤异常病变〔淋巴瘤样丘疹病，急性苔藓样糠疹〕疹〕 结果的解释和本卷须知结果的解释和本卷须知30例LyP病例TCR基因重排总体阳性率80%20例CALCL病例TCR基因重排总体阳性率100%，两组病例TCR基因重排阳性率无统计学差别〔P>0.05) 阐明TCR基因重排在LyP和CALCL的鉴别中无运用价值。

必需结合临床病史必需结合临床病史２．２．Ig和和TCR基因重排不一定是谱系的标志：基因重排不一定是谱系的标志：　　　　　某些　　　　　某些T、、B淋巴瘤有基因重排的交叉淋巴瘤有基因重排的交叉T,B之间：不成熟的T或B相对频繁TCRab, TCRrd之间前前T细胞性白血病细胞性白血病/细胞淋巴瘤细胞淋巴瘤几乎所有都存在几乎所有都存在TCR克隆性重排，但大克隆性重排，但大约约20%同时伴有同时伴有IGH基因重排基因重排前B细胞性白血病/淋巴瘤，非特殊类型均有IGH DJ 区克隆性重排＞70% 存在TCR， 重排对谱系鉴定无帮助毛细胞白血病共同表达多克隆性IG亚型，认为存在多点亚型转换阻滞T细胞大颗粒淋巴细胞白血病TCRγ，TCRβ克隆性重排，存在TCRγδ，TCRαβ交叉NK细胞慢性淋巴细胞增生异常没有IG和TCR克隆性重排侵袭性NK细胞白血病没有IG和TCR克隆性重排结外NK/T 细胞淋巴瘤，鼻型大多IG及TCR无重排，少数因存在反应性细胞毒性T细胞导致TCR克隆性重排肝脾T细胞淋巴瘤TCRγ克隆性重排Γδ来源的存在等位的TCRγ克隆性重排αβ来源的一部分存在TCRβ克隆性重排，一部分未产生TCRβ克隆性重排蕈样霉菌病蕈样霉菌病部分存在部分存在TCR克隆性重排克隆性重排原发性皮肤CD30+T细胞淋巴增生性疾病60%存在TCR克隆性重排，TCR克隆性重排与淋巴瘤相关原发皮肤Tγδ细胞TCRγδ克隆性重排；TCRβ克隆性重排可能存在或缺失，但不表达血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤75-90%：TCR克隆性重排25-30%：IG克隆性重排，与EBV+B细胞相关间变大细胞淋巴瘤，ALK+90%存在TCR克隆性重排与是否表达T细胞抗原无关，10%不存在IG和TCR克隆性重排间变大细胞淋巴瘤，ALK-多数存在TCR克隆性重排与是否表达T细胞抗原无关肠病型T 细胞淋巴瘤（EATL）TCRβ，TCRγ克隆性重排在各种形态学亚型均存在T细胞幼淋巴细胞白血病TCRβ、TCRγ克隆性重排(1)少量淋巴细胞 (2)小标本或高负荷B细胞淋巴瘤中有少量反响性T细胞(3)EBV或CMV感染(4)免疫抑制患者(5) 淋巴结或外周血中TCR的某些组分重排占优势,重排多样性受限制,可出现寡克隆信号。

6)假克隆和寡克隆信号表现：弱条带或两条以上条带(7)区分方法： 多次反复，大小不同的条带 (8) (9)只需那些可反复的一样大小的条带是可信的单克隆性条带(10) 3. 假克隆和寡克隆假克隆和寡克隆4.淋巴瘤重排检出率不是淋巴瘤重排检出率不是100%假阴性假阴性 5.缘由：缘由：6.〔〔1〕早期未完成重排；有些〕早期未完成重排；有些类型淋巴瘤缺乏基因重排类型淋巴瘤缺乏基因重排7.〔〔2〕引物不全〕引物不全8.〔〔3〕与其他基因重排、突变；〕与其他基因重排、突变；9.〔〔4〕体细胞超突变〕体细胞超突变(eg. MCL vs FL)10.〔〔5〕检测敏感性限制〕检测敏感性限制11.〔〔6〕所用检测技术＼分析技〕所用检测技术＼分析技术术12.〔〔7〕不适宜的退火温度〕不适宜的退火温度13.处理方法：多组引物组合，　处理方法：多组引物组合，　仔细分析仔细分析14. 仅用一对引物时滤泡性淋巴瘤滤泡性淋巴瘤IG重链和轻链重排；由于其可变区存在大量的体细胞突重链和轻链重排；由于其可变区存在大量的体细胞突变，导致单对引物不易扩增出单克隆产物（变，导致单对引物不易扩增出单克隆产物（10-40%）。

多重多重PCR(BIOMED-2)引物可以检测出引物可以检测出90%的的IGH(V-D-J)基因重排，用此引物可以检测出基因重排，用此引物可以检测出100%IGH(D-J)和轻和轻链基因重排链基因重排慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤40-50%未突变的病例中存在IG基因重排，在未突变的病例BCR的意义非常重要，常和自身抗体反应相关幼B淋巴细胞白血病50%：IG未突变的重链克隆性重排所有病例具有VH3（68%）和VH4（32%）基因家族MALT淋巴瘤IG重链，轻链重排以及可变区体细胞突变结内边缘带淋巴瘤VH3和VH4家族明显突变的IG基因克隆性重排儿童结内边缘带淋巴瘤IG基因克隆性重排在区别该病和反应性增生作用大原发皮肤滤泡中心淋巴瘤具有体细胞高突变的克隆性IG重排，但有些不能被PCR检测到套细胞淋巴瘤IG克隆性重排，可变区基因大多未突变，但15-40%存在低量的突变弥漫性大弥漫性大B细胞淋巴瘤非特殊类型细胞淋巴瘤非特殊类型可检测到可检测到IG重链和轻链的克隆性重排重链和轻链的克隆性重排可变区存在体细胞高突变可变区存在体细胞高突变富于T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤肿瘤B细胞存在IG克隆性重排，IG存在体细胞突变和生发中心的细胞一致。

　5．假阳性：　技术缘由；PCR法影响要素多，严厉分区各种缘由所致的假克隆或寡克隆　　　　　产物分析区产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间公用走廊公用走廊任务流向任务流向扩增区扩增区标本制备区标本制备区试剂预备区试剂预备区产物分析区产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间公用走廊公用走廊任务流向任务流向扩增区扩增区标本制备区标本制备区试剂预备区试剂预备区设计A设计B•专门人员：完善技术和内容•专门空间：防止污染•结果分析：留意能够的圈套，必要时反复•综合判别：结合形状、免疫表型和病史谢谢 谢谢 !。