酶活测定方法.doc

酶活测定方法还原法 酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团在此反应体系中添加化学试剂 ,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质通过在特定的波长下 比色 ,即可求 出还原产物的含量 ,从而计算出酶活力的大小 色原底物法 通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物该底物与酶发生反应后 ,生色基团可被释放出来 ,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后 ,即可求出待测酶的活力粘度法 该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶 的活力木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大 为降低基 于Poiseuille定律我们知道 ,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后 ,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量 ,从而换算出酶活力的数值免疫学方法 常用 于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法 、免疫凝胶扩散法。

这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应 ,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应琼脂凝胶扩散法 将酶作用的底物与琼脂混合熔融后 ,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径 的小孔在点加酶样并培养24h以后 ,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力 蛋白酶活力测定法本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定1 福林法1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h取去冷凝器,加入硫酸锂(Li2SO4)50g,蒸馏水50mL,混匀,加入几滴液体溴,再煮沸15min,以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再煮沸除去之冷却后,定容至1000mL,用细菌漏斗(No4～5)过滤,置于棕色瓶中保存。

此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释即成已稀释的福林试剂1.1.2 0.4mol碳酸钠溶液: 称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g,定容至1000mL1.1.3 0.4mol三氯乙酸(T C A)溶液: 称取三氯乙酸(CCL3COOH)65.4g,定容至1000mL1.1.4 pH7.2磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.2g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(A液)称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.63g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(B液)取A 液28mL 和B 液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1mol pH7.2的磷酸盐缓冲液1.1.5 2%酪蛋白溶液:准确称取干酪素2g,称准至0.002g,加入0.1N氢氧化钠10mL,在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸),然后用pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL即成配制后应及时使用或放入冰箱内保存,否则极易繁殖细菌,引起变质1.1.6 100μg/mL酪氨酸溶液:精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g,逐步加入6mL 1N盐酸使溶解,用0.2N盐酸定容至100mL,其浓度为1000μg/mL,再吸取此液10mL,以0.2N盐酸定容至100mL,即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。

此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存,以免繁殖细菌而变质1.2 仪器a. 分析天平: 感量0.1mg;b. 581-G型光电比色计或72型分光光度计;c. 水浴锅;d. 1、2、5、10mL移液管等1.3 操作1.3.1 标准曲线的绘制1.3.1.1 按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(表1)表 1 配制各种不同浓度的酪氨酸溶液━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━┃ 管 号试 剂 ┣━━┳━━┳━━┳━━┳━━┳━━━┃ 1 ┃ 2 ┃ 3 ┃ 4 ┃ 5 ┃ 6━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━蒸馏水,mL ┃10 ┃ 8 ┃ 6 ┃ 4 ┃ 2 ┃ 0100μg/mL酪氨酸,mL ┃ 0 ┃ 2 ┃ 4 ┃ 6 ┃ 8 ┃ 10酪氨酸最终浓度,μg/ml ┃ 0 ┃ 20 ┃ 40 ┃ 60 ┃ 80 ┃ 100━━━━━━━━━━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━━1.3.1.2 测定步骤:取6支试管编号按表1分别吸取不同浓度酪氨酸1mL,各加入0.4mol碳酸钠5mL,再各加入已稀释的福林试剂1mL摇匀置于水浴锅中40℃保温发色20min在581-G型光电比色计上分别测定光密度(OD) (滤色片用65**#)或用72型分光光度计进行测定(波长660nm)。

一般测三次,取平均值将1～6号管所测得的光密度(OD)减去1号管(蒸馏水空白试验)所测得的光密度为净OD数为了清楚起见再列出表格如下 (表2)表 2━━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━┃ 管 号试 剂 ┣━━┳━━┳━━┳━━┳━━┳━━━┃ 1 ┃ 2 ┃ 3 ┃ 4 ┃ 5 ┃ 6━━━━━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━按表1制备的不同浓度酪氨酸,mL┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1━━━━━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━0.4mol/L Na2CO3,mL ┃ 5 ┃ 5 ┃ 5 ┃ 5 ┃ 5 ┃ 5━━━━━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━福林试剂,mL ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1━━━━━━━━━━┳━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━┃ 1 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃┣━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━┃ 2 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃O D值 ┣━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━┃ 3 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃┣━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━┃ 平均 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃━━━━━━━━━━┻━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━净O D值 ┃ 0 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃━━━━━━━━━━━━━━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━━以净O D值为横坐标,酪氨酸的浓度为纵坐标,绘制成标准曲线(或可求出每度OD所相当的酪氨酸量K)。

1.3.2 样品稀释液的制备1.3.2.1 测定酶制剂: 称取酶粉0.100g,加入pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL,吸取此液5mL,再用缓冲液稀释至25mL,即成5000倍的酶粉稀释液1.3.2.2 测定成曲酶: 称取充分研细的成曲5g,加水至100mL,在40℃水浴内间断搅拌1h,过滤,滤液用0.1mol pH 7.2磷酸盐缓冲液稀释到一定倍数(估计酶活力而定)1.3.3 样品测定: 取15×100mm试管3支,编号1、2、3(做2只也可),每管内加入样品稀释液1mL,置于40℃水浴中预热2min,再各加入经同样预热的酪蛋白1mL,精确保温10min,时间到后,立即再各加入0.4mol三氯乙酸2mL,以终止反应,继续置于水浴中保温20min,使残余蛋白质沉淀后离心或过滤,然后另取15×150mm试管3支,编号1、2、3,每管内加入滤液1mL,再加0.4mol碳酸钠5mL,已稀释的福林试剂1mL,摇匀,40℃保温发色20min后进行光密度(OD)测定空白试验也取试管3支,编号(1)、(2)、(3),测定方法同上,唯在加酪蛋白之前先加0.4mol三氯乙酸2mL,使酶失活,再加入酪蛋白。

为了清楚起见,分别列出表格于下 (见表3及表4)表 3━━━━━━━━━━┳━━━━━┳━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━┃ 管 号 ┃ 试 剂 ┃ 管 号试 剂 ┣━┳━┳━┫ ┣━━┳━━┳━━┃1 ┃2 ┃3 ┃ ┃(1) ┃(2) ┃(3)━━━━━━━━━━╋━╋━╋━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━预热酶液, mL ┃1 ┃1 ┃1 ┃预热酶液, mL ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1━━━━━━━━━━╋━╋━╋━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━预热2%酪蛋白, mL ┃1 ┃1 ┃1 ┃0.4mol三氯乙酸, mL ┃ 2 ┃ 2 ┃ 2━━━━━━━━━━┻━┻━┻━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━┻━━作用10min (精确计时) ┃作用10min (精确计时)┃ ┃━━━━━━━━━━┳━┳━┳━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━┳━━0.4mol三氯乙酸, mL ┃2 ┃2 ┃2 ┃预热2%酪蛋白, mL ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1━━━━━━━━━━┻━┻━┻━┻━━━━━━━━━━┻━━┻━━┻━━表 4━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━┃ 管 号试 剂 ┣━┳━┳━━┳━━┳━━┳━━━┃1 ┃ 2┃ 3 ┃(1) ┃(2) ┃ (3)━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━滤 液, mL ┃1 ┃ 1┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━0.4mol Na2CO3,mL ┃5 ┃ 5┃ 5 ┃ 5 ┃ 5 ┃ 5━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━福林试剂, mL ┃1 ┃ 1┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━O D值 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃━━━━━━━━━━╋━┻━┻━━╋━━┻━━┻━━━平均O D值 ┃ ┃━━━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━净O D值 ┃ ┃ 0━━━━━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━━━样品的平均光密度(O D)一空白的平均光密度(OD)=净OD值。

1.4 计算在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位A 1样品蛋白酶活力单位(干基)=━━×4×N×━━━ ……………………… (1)10 1 - W式中:A——由样品测得OD值,查标准曲线得相当的酪氨酸微克数(或OD值×K);4——4毫升反应液取出1 mL测定 (即4倍);N——酶液稀释的倍数;10——反应10min;W——样品水分百分含量1.5 注意事项以上介绍的方法用于测定中性蛋白酶(pH7.2)若要测定酸性蛋白酶或碱性蛋白酶,则把配制酪蛋白溶液和稀释酶液用的pH缓冲液换成相应pH缓冲液即可现把几种常用pH缓冲液配方提供如下:1.5.1 pH7.5磷酸盐缓冲液 (0.02mol/L)称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)6.02g和磷酸二氢钠 (NaH2PO4·2H2O)0.5g以蒸。