溶血磷脂酸上调THP1细胞基质金属蛋白酶9的表达及活性.doc

1溶血磷脂酸上调 THP1 细胞基质金属蛋 白酶9 的表达及活性【摘要】 目的 探讨基质金属蛋白酶 9(MMP 9)在溶血磷脂酶(LPA)致动脉粥样硬化中的作用及机制方法 以不同浓度 LPA(0～10 μmol/L）刺激人单核细胞株THP 1 细胞 4 h，RT PCR 法测定 MMP 9 mRNA 表达，酶谱法检测 MMP 9 活性，Western 印迹法检测核蛋白 NF κB p65 表达变化结果 随着 LPA 剂量的增加，MMP 9 表达及活性，核蛋白 NF κB p65 表达逐渐增强，在 LPA 1 μmol/L 时达到最高点，然后逐渐减弱，LPA 以剂量依赖的方式激活 NF κB，在转录水平促进 THP 1 细胞 MMP 9 mRNA 表达，增强 MMP 9 活性结论 LPA 可能通过激活 NF κB，在转录水平促进 THP 1 细胞 MMP 9 mRNA 表达，并增强其活性，促进粥样硬化发生和发展 【关键词】 溶血磷脂酸；THP 1 细胞；基质金属蛋白酶 9溶血磷脂酸（LPA)是一种结构简单，具有激素和生长因子样的磷脂信使近年来研究发现，LPA 具有促进动脉硬化和血栓形成的作用，因此引起极大重视〔1〕。

从血小板活化、内皮细胞功能障碍、诱导与维持血管壁炎症反应，到增加斑块的不稳定性、导致斑块破裂、局部栓子形成， 进而导致脑卒中或心肌梗死等缺血事件的发生等无不与 LPA 密切相关MMP 9，又称明胶酶 B，是 MMP 家族中的一个重要成员，对血管壁的基底膜和细胞外成分具有清除作用，使纤维帽崩溃影响斑块的稳定性MMP 9 不仅能促进动脉粥样硬化(AS)的发展〔2〕，并且是 AS 斑块不稳定的主要因素〔3〕单核巨噬细胞是参与粥样硬化的主要炎性细胞有研究表明，LPA 能活化单核细胞和 T 淋巴细胞，促进其表达和分泌 MMPs，而后者的表2达和活化是 LPA 导致斑块不稳定或破裂的主要因素之一〔4〕本研究应用 LPA 刺激体外培养的人单核细胞株 (THP 1)，观察 LPA 对 MMP 9 表达及活性变化以及核因子 NF κB 表达变化，进一步探讨 LPA 在致动脉粥样硬化中的作用及机制1 材料与方法1.1 材料Trizol Reagent 为 Invitrogen 产品；Taq DNA 聚合酶及缓冲系统、dNTP Mix为 Fermentas 产品，DNA Marker 和 RNasin 购自 TaKaRa，ReverTra Ace α TM First Strand cDNA Synthesls KIT 为 TOYOBO 产品，THP 1 为人单核细胞株，购自 BIOCHAIN 公司，18∶1 LPA 购自 Sigma Aldrich 公司，MMP 酶谱分析试剂盒（MMP 2、MMP 9)购自普利莱基因技术有限公司，细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(碧云天)。

1.2 细胞培养及干预试验THP 1 细胞培养于含 10％小牛血清的 RPMI1640 培养液中，37℃，5％CO2下生长THP 1 为悬浮型生长，2～3 d 换液，细胞生长至(4～6)×106／ml 时及时传代将 THP 1 细胞无血清培养过夜，以 106/孔接种于 24 孔培养板，分别以LPA 0、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L 处理 4 h 后收集细胞，以 RT PCR 法检测MMP 9 mRNA 水平酶谱法检测 MMP 9 活性提取细胞核蛋白以 Western 印迹法检测 NF κB p65 水平1.3 总 RNA 提取3用 Trizol 试剂提取细胞总 RNA，按照说明书进行将 1 μl(浓度按照 1 μg／μl计)总 RNA 反转录后行 PCRPCR 扩增体系 25 μl，其中含 2×PCR master 混合液12.5 μl，上、下游引物各 0.75 μl，cDNA 模板(逆转录产物)1 μl，以 Biometra PCR 仪(美国，UNO II 型)作热循环：预变性 94℃ 3 min；循环：94℃ 45 s、54℃ 45 s、72℃45 s、共 30 循环。

循环结束后 72℃10 minMMP 9 引物及内参 GAPDH 引物由Invitrogen 公司合成，引物序列如下：MMP 9 上游：5′ TCCCTGGAGACCTGAGAAC 3′，下游：3′ TTGATGAGCCTTCTGAACGG5′，扩增片断长度为 306 bp；GAPDH 上游：5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′，下游：5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3′，扩增片段长度 450 bp取 PCR 产物各 5 μl在 1.0％琼脂糖凝胶中电泳(120 V 恒压电泳 45 min)，应用 Gel Doc 2000 型全自动凝胶成像分析仪(Boi Rad 公司，美国)照相并测定每条带的光密度值，以GAPDH 表达量为内对照计算并比较各组样本 MMP 9 的相对表达量1.4 MMP 9 活性检测采用酶谱法检测按照蛋白抽提试剂盒操作说明抽提细胞总蛋白取 5 μl 阳性混合物与试剂 1(2 X SDS PAGE non reducing buffer，普利莱基因技术有限公司，P1700)混合等体积混合，待测样品 5 μl 按照 1∶1 稀释与试剂 l 混合后直接上样每孔 10 μl，不加热变性，以 30 mA 恒流电泳，溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。

小心去除压缩胶层，放入干净瓶皿中以适量蒸馏水冲洗凝胶以加入试剂 4(10 ml 1×buffer A)，室温漂洗凝胶 2×15 min中间换液 2 3 次倒掉 Buffer A，加入试剂5(10 ml 1×buffer B)，室温孵育 4 h凝胶加入 SDS PAGE 凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液于扫描仪上扫描凝胶，显示调整为灰度，并分析 IOD 值92 kD 为MMP 9，130 kD、225 kD 为 pro MMP 9）以对照组(LPA 0 μmol/L)条带的光密4度为 1同一条带上其余的与之对比，用此相对值反映酶活性的大小1.5 蛋白印迹分析收集细胞，按照核蛋白抽提试剂盒操作说明(碧云天公司)抽提细胞核蛋白，蛋白浓度由 BCA 法检测取 50 μg 蛋白样品与上样缓冲液变性行 SDS PAGE 电泳，电泳条件为 200 V电泳完毕后进行转膜，将电转膜置于 5％的脱脂奶粉中封闭，4℃过夜，以 PBST 漂洗膜 2～3 次，于加样槽中加入 NF κB p65 抗体约 1 ml(NF κB p65 1∶300，GAPDH 1∶10 000)，注意保证膜的所有部分同溶液接触，室温下于摇床孵育，PBST 洗涤 10 min，加入过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶1 000)，每个加样槽中加入二抗 1 ml 左右室温下于摇床孵育 1 h，注意保证膜的所有部分同溶液接触。

PBST 洗涤后进行 ECL 底物化学发光，暗室曝光 5～30 s，照相阳性条带以 Gel pr04.0 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其 IOD 值，以 GAPDH的表达量为内对照计算并比较各组样本的相对表达量1.6 统计学处理每组实验重复 3 次，数据以 x±s 表示各组间比较采用单因素方差分析(one way ANOVA)，所有统计分析均用 SPSS 16.0 软件进行2 结 果2.1 LPA 上调 THP 1 细胞 MMP 9 mRNA 表达LPA 0、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L 刺激 THP 1 细胞 4 h 后，THP 1 MMP 9 mRNA 分别为50.057±0.004，0.085±0.005，0.106±0.007，0.140±0.005，0.118±0.003，0.105±0.005，各组间差异有统计学意义(P＜0.05)LPA 以剂量依赖的方式诱导 THP 1 细胞MMP 9 mRNA 表达水平增高，在 LPA 1 μmol/L 时表达水平最高，与其余各组相比，差异显著（P0.01），见图 1 2.2 LPA 对 THP 1 细胞 MMP 9 活性的影响不同浓度 LPA 刺激 THP 1 细胞 4 h 后，THP 1 细胞 MMP 9 活性与基础水平对照组(LPA，1 μmol/L)相比，以剂量依赖的方式增加。

LPA 0.1、0.5、1.5、10 μmol/L 时，MMP 9 活性分别为对照组(1.16±0.35)、(1.37±0.03)、(1.63±0.04)、(1.38±0.02)、(1.29±0.01)倍(P＜0.05）， LPA 1 μmol/L 时活性最强，与其余各组相比，差异有显著性（P0.01)，与 MMP 9 mRNA 表达水平一致2.3 LPA 诱导 THP 1 细胞 NF κB p65 活化Western 印迹结果显示，不同浓度 LPA 刺激 THP 1 细胞 4 h 后，在 LPA 以剂量依赖方式激活 NF κB p65，核蛋白 NF κB p65 表达水平增加，在 1 μmol/L 活性最强(LPA 0、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L 时，THP 1 细胞核蛋白 NF κB p65 吸光度比值分别为 0.25±0.01，0.31±0.01，0.43±0.01，0.58±0.02,0.45±0.02,0.44±0.02，组间差异有显著性(P＜0.05)3 讨 论MMP 9 可由中性粒细胞，单核巨噬细胞，血管内皮细胞等多种细胞合成并以无活性酶原形式分泌，通过纤溶酶等水解而活化，其作用底物包括明胶Ⅳ、V 型明胶原、弹性蛋白等。

病理情况下潜在型 MMP 9 被激活，表达上调，主要通过血管中膜平滑肌细胞迁移、增殖、凋亡〔5～7〕及细胞外基质的重塑〔8〕MMP 9 主要通过6粥样斑块基底膜和纤维帽的重要成分 V 型胶原的降解、中膜平滑肌细跑向内膜迁移，加速 AS 进程并导致不稳定斑块的形成〔8〕MMP 9 过度表达在血管重构中起到重要作用，通过降解细胞外基质，增大管径、内膜面积及细胞核密度，为斑块的生长提供空问，当这种过程达到极点，无法阻止时，可导致斑块破裂我们在此前的研究中发现，颈部存在不稳定斑块的脑梗死患者血清 MMP 9 浓度显著增高〔9〕，并且 MMP 9 在不稳定冠状动脉粥样斑块的表达显著高于稳定斑块组〔10〕，表明 MMP 9 是形成不稳定性斑块的一个重要促进因素LPA 积聚在粥样斑块内膜处，并且在斑块脂质核心处含量最高〔11〕大鼠粥样硬化斑块模型中，LPA 和 MMP 9 水平均显著升高，二者呈正相关〔12〕本研究发现，LPA 以剂量依赖的方式上调 THP 1 细胞 MMP 9 mRNA 表达，并相应促进其活性增加同时激活 NF κB p65，促使核蛋白 NF κB p65 表达水平增加MMP 9的调节主要通过基因转录、酶原激活及 MMP 生理性抑制物(TIMP 1)3 个水平实现，其转录水平的调节可能通过转录因子活化蛋白 I(Ap 1)和核转录因子 NF κB途径实现。

NF κB 为一组转录调节因子，通常以二聚体形式与其抑制蛋白Ⅰ κB 结合存在于细胞浆中当细胞受到各种刺激(包括细胞因子、缺氧、病毒、细菌感染等)后，Ⅰ κB 磷酸化，从而使 NF κB 活化，由胞浆转移到细胞核内，与基因操纵子的NF κB 特异性位点结合，启动基因转录因此，LPA 可能通过激活 NF κB，在转录水平促进 THP 1 细胞 MMP 9 mRNA 表达，并增强其活性，促进 AS 发生发展以及不稳定斑块的形成，从而促使血管事件的发生针对 LPA 增强 MMP 9 活性的机制和意义进一步深入研究对于防治 AS，稳定斑块，减少血管事件的发生有7可能提供新的方向和线索参考文献】1 Xu YJ，Aziz OA，Bhugra P，et al.Potential role of lysophosphatidic acid in hypertension and at。