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Biacore的实验设计和流程的实验设计和流程陈陈 媛媛 媛媛2011-10-202021/8/61Biacore 分析的基本步骤分析的基本步骤Ligand偶联到芯片表面偶联到芯片表面Analyte进样进样再生再生a n a ly telig a n d2021/8/622021/8/63Biacore 分析的第一步：偶联分析的第一步：偶联•什么是偶联什么是偶联?–利用共价结合或捕获的方式将目标样品偶联在芯片表面利用共价结合或捕获的方式将目标样品偶联在芯片表面•须考虑的因素须考虑的因素–哪个分子作为哪个分子作为 ligand?–哪种传感芯片哪种传感芯片?–怎样偶联怎样偶联?–偶联水平偶联水平?2021/8/64Ligand的选择标准的选择标准•分子大小：分子量小的做为分子大小：分子量小的做为Ligand•偶联的难易和对分子活性的影响偶联的难易和对分子活性的影响•生物分子的稳定性：偶联活性稳定的分子有利于实验的重复性和芯片生物分子的稳定性：偶联活性稳定的分子有利于实验的重复性和芯片 的使用寿命的使用寿命•生物分子的纯度生物分子的纯度: 共价（共价（covalent）：结合选择纯度更高的分子）：结合选择纯度更高的分子 捕获（捕获（capture）：纯度要求不高）：纯度要求不高2021/8/65•化合价：结合实验化合价：结合实验-----与化合价无关与化合价无关 动力学实验动力学实验----将多价的分子做为将多价的分子做为Ligand•与芯片的非特异结合与芯片的非特异结合: 与芯片有非特异结合的分子不能做为与芯片有非特异结合的分子不能做为Analyte2021/8/66应该选择哪种传感芯片应该选择哪种传感芯片?Biacore为各种仪器提供为各种仪器提供9种传感芯片满足广泛的实验需种传感芯片满足广泛的实验需求求2021/8/67传感器芯片传感器芯片金膜金膜玻璃玻璃羧基化的葡聚糖Alkanethiol moleculesCarboxymethylated dextran•提供亲水环境提供亲水环境•提供生物分子共价结合的化学基础提供生物分子共价结合的化学基础•惰性分子惰性分子•柔性柔性2021/8/68传感芯片传感芯片 CM5•羧基化的葡聚糖表面羧基化的葡聚糖表面•最常用的传感芯片最常用的传感芯片•卓越的化学稳定性卓越的化学稳定性实验的首选实验的首选2021/8/69氨基偶联的注意事项氨基偶联的注意事项 PI (等电点等电点) ：判断是否可以进行氨基偶联，：判断是否可以进行氨基偶联，PI要求不小于要求不小于4•配体通过静电效应，配体带正电、葡聚糖带负电，聚集在芯片表面配体通过静电效应，配体带正电、葡聚糖带负电，聚集在芯片表面pH = pI 蛋白质等电点蛋白质等电点 ：： 该该 pH 下目标蛋白不带电荷下目标蛋白不带电荷pH < pI 蛋白质等电点蛋白质等电点 : 目标蛋白带正电荷目标蛋白带正电荷pH > pI 蛋白质等电点蛋白质等电点 : 目标蛋白带负电荷目标蛋白带负电荷2021/8/610预实验预实验--preconcentration•使用不同使用不同PH值的值的10mM NaAc 缓冲液溶解配体，注射缓冲液溶解配体，注射1-2分钟左右分钟左右•配体浓度：参考配体浓度：参考 30-50KD蛋白为例，准备蛋白浓度蛋白为例，准备蛋白浓度10-50ug/ml•根据预结合得到的实验结果判断最合适的偶联根据预结合得到的实验结果判断最合适的偶联PH值值•相同时间内结合的越多，峰型越陡，并且没有饱和现象出相同时间内结合的越多，峰型越陡，并且没有饱和现象出现的为最适现的为最适PH值值•如果相邻如果相邻PH的结合结果相差不多，选用靠近中性的的结合结果相差不多，选用靠近中性的PH值值2021/8/611–纯度：纯度： 高于高于90%–偶联缓冲液偶联缓冲液 10mM sodium acetate buffer， 3.5 < pH < pI 低离子低离子强强度，溶液中没有氨基和其它度，溶液中没有氨基和其它强强的的亲亲核基核基团团 –偶联量：通过浓度和注射时间来控制偶联量：通过浓度和注射时间来控制–优点优点：：共价化学键，高偶联量共价化学键，高偶联量–缺点缺点：失活，：失活，常为不均一的表面常为不均一的表面2021/8/612Immobilization procedures•Pre-concentration: pH scouting•Activation: EDC/NHS•Inject the ligand solution•Deactivation: Ethanolamine2021/8/613传感芯片传感芯片 CM4 和和 CM3•传感芯片传感芯片 CM4–羧基化的葡聚糖表面，羧基化程度低于羧基化的葡聚糖表面，羧基化程度低于CM5 (所带的负电所带的负电荷较少荷较少)–减少了对带强正电荷蛋白的非特异性结合，例如在细胞的减少了对带强正电荷蛋白的非特异性结合，例如在细胞的水解样品和匀浆中水解样品和匀浆中–比较容易得到较低的比较容易得到较低的 Rmax，便于进行动力学研究，便于进行动力学研究•传感芯片传感芯片 CM3–羧基化的葡聚糖表面羧基化的葡聚糖表面–葡聚糖链长度较葡聚糖链长度较 CM5 短短, 但羧基化程度相同但羧基化程度相同–适用于细胞、病毒和多组分的混合物适用于细胞、病毒和多组分的混合物–便于得到较低的偶联水平便于得到较低的偶联水平2021/8/614传感芯片传感芯片 SA•在羧基化的葡聚糖表面覆盖了一层链霉生物素（在羧基化的葡聚糖表面覆盖了一层链霉生物素（streptavidin））•非常适合用于捕获生物素标记的非常适合用于捕获生物素标记的DNA大片段，进行核酸之间的相大片段，进行核酸之间的相互作用研究互作用研究•可捕获生物素标记的配体，如糖类、肽段，蛋白质，可捕获生物素标记的配体，如糖类、肽段，蛋白质，DNA等等•捕获（捕获（capture）方式：）方式：位点特异性，定向偶联，偶联量低位点特异性，定向偶联，偶联量低2021/8/615•链霉生物素和生物素的亲和力很高，因此捕获的分子很难从芯片上洗链霉生物素和生物素的亲和力很高，因此捕获的分子很难从芯片上洗下，类似于共价偶联下，类似于共价偶联 KD=10-15 M2021/8/616传感芯片传感芯片 NTA•在羧基化的葡聚糖表面覆盖了一层氨三乙酸（在羧基化的葡聚糖表面覆盖了一层氨三乙酸（NTA））•通过金属螯合作用捕获带有末端组氨酸修饰（通过金属螯合作用捕获带有末端组氨酸修饰（His-tagged）的配）的配体蛋白分子体蛋白分子2021/8/617•空间定向结合能很好地保持生物分子的空间结构，捕获方式空间定向结合能很好地保持生物分子的空间结构，捕获方式•只需普通的再生条件，只需普通的再生条件，EDTA•纯化条件可提供参考：低浓度咪唑洗脱的蛋白偶联在纯化条件可提供参考：低浓度咪唑洗脱的蛋白偶联在NAT芯片上芯片上,基线基线可能不稳定，对于小分子的可能不稳定，对于小分子的analyte和动力学分析有影响和动力学分析有影响•NTA芯片价格贵芯片价格贵2021/8/618传感芯片传感芯片 HPA•疏水表面疏水表面•适用于单层脂质分子和膜相关蛋白的相互作用分析适用于单层脂质分子和膜相关蛋白的相互作用分析•为细胞膜相关蛋白的相互作用分析提供了增溶技术为细胞膜相关蛋白的相互作用分析提供了增溶技术•研究细胞膜受体在膜环境内与配体的相互作用研究细胞膜受体在膜环境内与配体的相互作用2021/8/619传感芯片传感芯片 L1–在羧基化的葡聚在羧基化的葡聚糖表面覆盖了一糖表面覆盖了一层亲脂物质层亲脂物质–适用于在保持磷适用于在保持磷脂双分子层的结脂双分子层的结构的同时，快速构的同时，快速和高重复性地捕和高重复性地捕获脂质体分子获脂质体分子–不需对锚定的分不需对锚定的分子进行合并子进行合并2021/8/620传感芯片传感芯片 – 总结总结•CM5 最常用的传感芯片最常用的传感芯片•CM4 为获取更低的为获取更低的Rmax，并减少类似于在天然样品中发，并减少类似于在天然样品中发 生的非特异性结合生的非特异性结合•CM3 为获取更低的配体偶联水平，应用于细胞、病毒和为获取更低的配体偶联水平，应用于细胞、病毒和 其他大分子量的待分析物其他大分子量的待分析物•SA 捕获生物素标记的配体捕获生物素标记的配体•NTA 捕获捕获His-tag修饰的配体修饰的配体•HPA 构建细胞膜的研究模型构建细胞膜的研究模型•L1 直接捕获脂质体分子并维持其活性直接捕获脂质体分子并维持其活性2021/8/621哪种偶联水平是恰当的哪种偶联水平是恰当的?•配体的偶联水平决定了配体和分析物分子的结合值的高低配体的偶联水平决定了配体和分析物分子的结合值的高低•Rmax 描述了分析物结合配体时的最大蛋白结合量描述了分析物结合配体时的最大蛋白结合量•当做结合实验时，希望得到结合大一些的信号，因此芯片表面当做结合实验时，希望得到结合大一些的信号，因此芯片表面偶联的水平要尽量高一些。

偶联的水平要尽量高一些•当做亲和力实验时，为使实验准确，希望当做亲和力实验时，为使实验准确，希望Rmax低一些，通常为低一些，通常为50RU左右，因此芯片表面偶联的水平要低一些左右，因此芯片表面偶联的水平要低一些RL = 芯片表面的偶联水平芯片表面的偶联水平 Sm = 化学计量比化学计量比1：：1•理论的理论的 Rmax 往往高于实际的往往高于实际的 Rmax2021/8/622Biacore 分析的第二步分析的第二步Ligand偶联到芯片表面偶联到芯片表面Analyte进样进样再生再生a n a ly telig a n d2021/8/623样品注意事项样品注意事项•分析物的纯度如何分析物的纯度如何? 通常的分析样品为纯品，通常的分析样品为纯品，Biacore也可分析混合物：如：血也可分析混合物：如：血 液、细胞提取液、中药提取液等液、细胞提取液、中药提取液等•分析物是否有活性分析物是否有活性?• 选择合适的温度、缓冲溶液等选择合适的温度、缓冲溶液等•是否存在非特异性结合是否存在非特异性结合? 提前了解分析物特性或通过空白通道进行观察提前了解分析物特性或通过空白通道进行观察•应该采取怎样的进样时间和流速应该采取怎样的进样时间和流速? 通常的进样时间为通常的进样时间为2-3分钟，流速不小于分钟，流速不小于10µl/min,建议使用建议使用20µl/min，可以根据不同的实验进行调整。

可以根据不同的实验进行调整2021/8/624•样品的浓度：样品的浓度： 和亲和力有关和亲和力有关•样品是否均一：分析物的溶解性要好，可以通过样品是否均一：分析物的溶解性要好，可以通过0.2um的滤膜的滤膜•样品是否容易发生聚合样品是否容易发生聚合?2021/8/625必需的缓冲液条件必需的缓冲液条件•必须以必须以 0.2 µm 膜过滤并抽气膜过滤并抽气•绝大多数常用的缓冲液体系都适用于绝大多数常用的缓冲液体系都适用于 Biacore•多数情况下，在仪器运行缓冲液中加入表面活性剂多数情况下，在仪器运行缓冲液中加入表面活性剂P20或吐温或吐温 0.005%-0.05%•该研究分子是否需要特殊的添加剂该研究分子是否需要特殊的添加剂?•样品是否需有机溶剂处理以增加溶解度样品是否需有机溶剂处理以增加溶解度•HBS-EP buffer: 10mM HEPES, Ph7.4,150mM NaCl,3mMEDTA,0.005%Tween20•PBS buffer2021/8/626结合与容积差（结合与容积差（Bulk Effects））•容积差是因为仪器缓冲液和样品溶液折射率的不同而产生容积差是因为仪器缓冲液和样品溶液折射率的不同而产生•因此因此 Biacore实验需要仪器缓冲液和样品缓冲液保持一致实验需要仪器缓冲液和样品缓冲液保持一致Buffer 1Binding + BulkBuffer 12021/8/627对照表面（对照表面（Reference surfaces））•如果样品溶解缓冲液和仪器运行缓冲液成分不同，容积差可通过如果样品溶解缓冲液和仪器运行缓冲液成分不同，容积差可通过设置对照表面来消除设置对照表面来消除•Fc2-1, Fc4-3, Fc4-1,3-1,2-1•当对进样过程进行分析时，对照表面的消减对检测结果非常重要当对进样过程进行分析时，对照表面的消减对检测结果非常重要2021/8/628对照表面的设计对照表面的设计 •空白表面空白表面–适用于大多数实验适用于大多数实验–检查和葡聚糖表面相关的非特异性结合检查和葡聚糖表面相关的非特异性结合•经活化经活化-失活处理的表面失活处理的表面–按照偶联的步骤处理芯片，但不偶联配体按照偶联的步骤处理芯片，但不偶联配体–减少了芯片表面携带的负电荷，从而减少非特异性结合减少了芯片表面携带的负电荷，从而减少非特异性结合•偶联了伪装配体（偶联了伪装配体（dummy ligand）的表面）的表面–将一种不与分析物结合的蛋白偶联于芯片上，而且与真实配体将一种不与分析物结合的蛋白偶联于芯片上，而且与真实配体的偶联水平相同的偶联水平相同2021/8/629芯片表面测试芯片表面测试•在实际分析开始前，进行一次进样操作在实际分析开始前，进行一次进样操作•使用常规的分析物浓度使用常规的分析物浓度•传感图能提供有用的分子相互作用信息传感图能提供有用的分子相互作用信息•用来估计对照表面上的非特异性结合水平用来估计对照表面上的非特异性结合水平-400-20002004006008001000120050100150200250300TimesResponseRU对照表面活化表面2021/8/630Biacore 分析的第三步分析的第三步Ligand偶联到芯片表面偶联到芯片表面Analyte进样进样再生再生2021/8/631再生再生•将和配体结合的分析物分子从芯片表面彻底除去将和配体结合的分析物分子从芯片表面彻底除去 •必须保持芯片表面的活性必须保持芯片表面的活性•有效的再生对获得高质量的分析数据至关重要，也是实验的难点有效的再生对获得高质量的分析数据至关重要，也是实验的难点2021/8/632测试再生的环境测试再生的环境•有效的再生能够去除所有结合的分析物分子有效的再生能够去除所有结合的分析物分子•重复对分析物做一次进样，以检测是否配体维持了原有的活性重复对分析物做一次进样，以检测是否配体维持了原有的活性•结合和再生的过程必须进行多次重复，以完全确保选择的再生结合和再生的过程必须进行多次重复，以完全确保选择的再生环境的有效性环境的有效性2021/8/633再生环境的选择再生环境的选择当配体分子是蛋白质时当配体分子是蛋白质时:1. 高高 pH (1-100 mM NaOH)2. 低低 pH (10 mM glycine-HCl, 从从 pH 3 至至 pH 1.5)3. 10 mM HCl, 100 mM H3PO44. MgCl2 (1-4 M), NaCl (1-5M)当从当从RNA或或DNA表面再生蛋白时，再生条件：表面再生蛋白时，再生条件：1.0.05—0.5%SDS2.50 mM NaOH含含1M NaCl2021/8/634再生效率再生效率•在常规情况下在常规情况下–理想的再生理想的再生: –通过多次的进样，结合曲线都基本维持稳定，和第一次进样相比，通过多次的进样，结合曲线都基本维持稳定，和第一次进样相比，响应值的变化在响应值的变化在10%之内之内–过于温和的环境过于温和的环境: –结合曲线逐渐降低，基线值逐渐增高结合曲线逐渐降低，基线值逐渐增高–过于苛刻的环境过于苛刻的环境:–结合曲线逐渐降低，基线维持稳定或逐渐降低结合曲线逐渐降低，基线维持稳定或逐渐降低2021/8/635Biacore分析动力学和亲和力分析动力学和亲和力2021/8/636什么是动力学和亲和力什么是动力学和亲和力?•动力学动力学–反应发生的速度反应发生的速度? – 与时间相关与时间相关–结合结合 – 分子间结合的速度分子间结合的速度–解离解离 – 分子复合物解离的速度分子复合物解离的速度–动力学分析能够确定在一个给定的时间跨度内，分子复合物是否能动力学分析能够确定在一个给定的时间跨度内，分子复合物是否能够结合还是完全解离够结合还是完全解离•亲和力亲和力–分子间结合的强度分子间结合的强度? – 与时间无关与时间无关–亲和力分析能够确定反应处于平衡状态（结合与解离形成动态平衡）亲和力分析能够确定反应处于平衡状态（结合与解离形成动态平衡）时，复合物的浓度时，复合物的浓度2021/8/637同样的亲和力，不同的动力学同样的亲和力，不同的动力学•所有所有4个化合物的亲和力数据相同个化合物的亲和力数据相同 KD = 10 nM = 10-8 Mkon koff (M-1s-1) (s-1)106 10-2105 10-3104 10-4103 10-5时间时间浓度浓度 = 1000 nM30 min60 min所有靶位所有靶位点被占据点被占据Response时间时间30 min60 min浓度浓度 = 100 nM2021/8/638用用Biacore获得动力学和亲和力数获得动力学和亲和力数据的据的2种方式种方式监测结合和解离速率监测结合和解离速率亲和力亲和力 动力学动力学 监测稳态水平监测稳态水平亲和力亲和力 动力学动力学2021/8/639传感图中的信息传感图中的信息•Rmax, Req 和和 KD的关系的关系2021/8/640动力学动力学2021/8/641平衡态平衡态2021/8/642动力学分析必须考虑的几个因素动力学分析必须考虑的几个因素•试剂纯度：试剂纯度： 90%以上以上•解离区域至少要超过结合量的解离区域至少要超过结合量的10%•偶联水平：偶联量要低一些，使偶联水平：偶联量要低一些，使Rmax尽量控制在尽量控制在20-50RU左右，减少物质迁移的影响左右，减少物质迁移的影响•配体活性，浓度定量要准确配体活性，浓度定量要准确•样品流速：样品流速： 不低于不低于30ul/min•浓度应该覆盖所有范围的结合曲线（低浓度浓度应该覆盖所有范围的结合曲线（低浓度—饱和浓度）饱和浓度）•设置至少一个浓度的样品重复，至少设置至少一个浓度的样品重复，至少5个分析物浓度个分析物浓度•设置零浓度样品设置零浓度样品2021/8/643预实验预实验•10mM NaAc是否沉淀是否沉淀•Analyte是否与芯片结合是否与芯片结合2021/8/644小分子实验小分子实验2021/8/645缓冲液准备•缓冲液的选择：缓冲液的选择：Phosphate buffer better than Hepes for very sensitive work•DMSO (max 10%)，通常是，通常是5%DMSO，可溶性好，也可，可溶性好，也可1%DMSO•使用高质量使用高质量DMSO•需要时加入需要时加入detergent•缓冲液缓冲液0.22um过滤（过滤（Teflon, nylon or polypropylene when DMSO））2021/8/646溶剂校正溶剂校正•空白对照有更多的空白对照有更多的DMSO结合空间，不同样品结合空间，不同样品DMSO浓度可能也有所不同浓度可能也有所不同2021/8/647Sample preparation•Check for sample aggregation or precipitation on dilution from stock•Seal vials, plates and buffers immediately to avoid evaporation•Ensure that all equipment is resistant to DMSO•Match samples and buffers as closely as possible•Contaminations from glassware and plastic vials can affect the results2021/8/648ITC实验实验2021/8/649Preparation of samples is critical•Matching of component buffers: Dialysis, Heat of dilution :injection of the ligand solution into the cell buffer•Concentrating the experimental samples •Error in the concentration of macromolecule in the cell will directly affect the stoichiometry; while error in the concentration of ligand will affect all three fitted parameters of the binding experiment (KA, N, DH). • [protein in cell]/Kd : 10