线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型的改进与体会.doc

1线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型的改进与体会【摘要】 　　目的建立一种操作简便、稳定可靠的局灶性脑缺血模型方法分别按 Zealonga 线栓法和改进线栓法制作局灶性大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion， MCAO)模型，并于术后 24 h 从神经行为学，脑梗塞率、脑梗塞率的相对标准偏差(RSD)和模型成功率 4 个方面对两种模型进行评价结果术后存活的动物均出现了神经功能缺陷症状，两组动物的脑梗塞率相比没有显著性差异（P > 0.05） ，但改进组较 Zea-longa 组的变异度小，模型成功率高（χ2 =4.37，P < 0.05） 结论改进法简便可靠，模型成功率高，是较理想的 MCAO 模型制作方法 【关键词】 线栓法 脑缺血 模型Abstract：To establish a simple， stable and reliable model of focal cerebral ischemia. MethodsAlong with Zealonga method and modified method， the models of middle cerebral artery occlusion were created. Then after 24 h of operation， these two kinds of model were evaluated by four aspects: the neurological behavior， the cerebral infarction ratio， the relative standard deviation (RSD) of cerebral infarction ratio and the achievement ratio of 2model.Results All the survival rats demonstrated neurological deficit symptom after 24 h of operation. The cerebral infarction ratio between the two groups was not significant. The RSD of cerebral infarction ratio in the modified group was lower than that in the Zea-longa group while the success rate in the modified group were higher than that in the Zealonga group（χ2 = 4.37， P < 0.05）.ConclusionThe modified method of focal cerebral ischemia model is easier to carry out and more reliable. And it is an ideal method for model of MCAO with higher success rate.Key words：Suture-occluded method； Cerebral ischemia； Model脑卒中是当今严重危害人类健康的一种常见病，相当于中医上的中风病。

本病可分为缺血性和出血性两大类，其中缺血性约占本病的 70%［1］ 与出血性脑卒中相比，脑缺血具有“三高一低”的特点，即高发病率、高致残率、高复发率、低死亡率其致残率和程度均超过脑出血制备一种理想的动物模型是研究该类疾病的重要手段目前脑缺血动物模型有许多种，其中线栓法制作的局灶性脑缺血模型具有不开颅、梗塞部位较确定、缺血时间可控、可用于研究脑缺血再灌注等优点，在国内外得到了广泛的采用但是，3该模型的制作难度大、死亡率高、变异度大，成为脑缺血实验研究中的拦路虎本实验室参照 Zea Longa 的制作方法并加以改进，通过使栓线前处理一致化，减少组织分离、加强术后护理等一系列措施，简化了实验的手术操作过程，提高了建模成功率和稳定性现报道如下1 器材1.1 动物及分组 Wistar 大鼠 50 只，雌雄各半，体重250～ 300 g，随机分为 2 组：Zea Longa 方法模型组（简称 ZL 组）和改进模型组，每组 25 只1.2 材料、仪器与试剂手术显微镜（XSO-1B 型，杭州医用光仪厂） ，十万分之一天平（HM-202 型，日本 A&G 有限公司） ，HHS 精密电热恒温水浴锅( 江苏金坛市医疗仪器厂) ，市售鱼线，手术器械。

红四氮唑（TTC，上海华东师范大学化工厂生产，批号2007507） ，氯化钠注射液（山东鲁抗晨欣药业，批号：070511708） 磷酸二氢钾（天津市天新精细化工开发中心，批号20079208） ，2 实验方法42.1 Zea Longa 制作模型的方法［2］ 栓线的制备： 原 Zea Longa 用的是 4 0 的单股尼龙手术线，因来源困难采用同直径的鱼线代替，将鱼线的顶端烫成光滑球面作为栓线手术过程：大鼠麻醉后，取颈部正中切口，分离颈总动脉(common carotid artery， CCA)、颈外动脉 (external carotid artery， ECA)和颈内动脉(internal carotid artery， ICA)，分离结扎并切断 ECA 及其分支，结扎 ICA 颅外的唯一分支 -翼腭动脉(pterygopalatine artery， PPA)用动脉夹夹闭 CCA 和 ICA，将栓线由 ECA 残端进线，经分叉处进入 ICA，进约 18 mm 稍有阻力感时即已达阻断大脑中动脉(middle cerebral artery， MCA)的入口，即可造成 MCA 的栓塞。

2.2 改进后的模型制作方法栓线的制备：将直径 0.235 mm 的鱼线剪成 3 cm 长的小段，将头段靠近酒精灯的外焰，调节距离以不使鱼线过热打卷为度，加热约 10 min，在显微镜下筛选出头端圆滑的鱼线，酒精擦拭晾干备用5手术过程：用质量分数为 2.5%戊巴比妥钠(0.05 g·kg-1 体重)腹腔注射麻醉，仰卧位固定颈部左侧正中切口，从两侧颌下腺之间剪开浅筋膜，显露一侧胸锁乳突肌钝性分离胸锁乳突肌与胸骨舌骨肌间的肌间隙，暴露颈总动脉和迷走神经滴上少许利多卡因，以减少对迷走神经的刺激手术显微镜下仔细分离 CCA 约 5 mm，并于近心端结扎，仅分离 ICA 及 ECA 近分叉处一小段，能穿线即可在 ECA 根部近分叉处结扎，ICA 根部近分叉处打一活结 剪断CCA，将栓线由 CCA 残端插入 ICA调整鱼线头端的方向使其略朝向腹两侧，进约 18 mm 稍有阻力感时应立即停止，收紧颈内动脉的活结，如果只插进 10 mm 就有明显阻力则提示误插进了 PPA这时拔出后调整方向再插，直到正确插入仔细清理净手术创口，缝合手术切口，注射抗生素将动物放置于温暖环境修养，定时对动物进行按摩护理2.3 检测指标及方法2.3.1 神经行为学评分在术后 24 h 参照 Zea-longa 的分级标准进行行为学评分：0 分，无神经缺损体征； 1 分，不能充分屈曲右侧前爪；2 分，向右侧转； 3 分，向右侧倾倒； 4 分，不能自发行走，意识丧失。

2.3.2 脑梗塞率及稳定性的评定两组大鼠在术后 24 h 冰上断6头取脑，-20℃ 冷冻约 15 min待其稍变硬时，用刀片将脑切成厚2 mm 的冠状切片浸于质量分数为 2%的 TTC 磷酸盐缓冲液中（pH=7.4） ［3］ ，恒温浴槽中 37℃避光孵育约 15 min，翻面继续染 15 min正常脑组织染为深红色，脑梗塞区不染色(苍白色)通过重量法测量脑的梗塞率，即：先称取全脑的重量 Tm，随后仔细分离脑组织中梗塞部分并称重 Pm，梗塞率 (%)=（Pm / Tm）×100%，并计算出相对标准偏差（RSD） 2.3.3 模型成功率的计算 将存活的动物进行 TTC 脑片染色，如果出现梗死灶则视为模型成功模型成功率(%)=成功动物数/该组动物总数×100%. 2.3.4 统计学处理两组间脑梗塞率的比较采用 t 检验，模型成功率的比较采用 χ2 检验3 结果3.1 神经功能评估和术后存活情况 两组动物在术后均出现了神经功能缺陷症状在术后 24 h 内，ZL 组共有 12 只动物死亡，其中 6 只死于呼吸困难， 4 只死于颅内血管刺破出血， 1 只死于失血过多，1 只死于梗塞面积过大；改进组中共有 5 只死亡，其中 3 只死于颅内出血，2 只死于呼吸困难。

73.2 脑梗死率及稳定性的评定所有动物均出现了梗塞灶，ZL对照组和改进组的脑梗塞率分别为(22.39±9.82)%和(21.18±5.65)%，两组相比没有显著性差异（P > 0.05） 两组的 RSD 分别为43.86%和 26.68%，提示改进组较 ZL 组脑梗塞率稳定 3.3 模型成功率的比较 如表１所示，改进组的模型成功率高于 ZL 组（χ2 = 4.37， P =0.037） 表 1 两组实验动物模型成功率的比较（略）χ2=4.37， P＜0.05;n=254 讨论4.1 动物的体重的选择要适当在预实验发现，体重越小，死亡率越高180 g 以下的大鼠死亡率可达 70%，而 350 g 以上的大鼠死亡率则在 10%以下，但是体重过大的大鼠由于血管变粗，模型成功率并不高本实验选择体重在 250～300 的大鼠，发现获得的模型成功率较理想（80%） 4.2 栓线的质量很重要 栓线的前端须光滑，否则易刺破血管造成颅内出血Zea Longa 将栓线头端烧制成球状，但其直径不易控制，很难到达一致，因而影响模型的稳定性和重复性我们将栓8线头端在高温处烤光滑而不烧成球状，大小均匀，既不易刺破血管又可减小变异度。

4.3 采取颈左侧切口出血较颈正中切口少，手术视野暴露充分4.4 滴上少许利多卡因可以减轻对迷走神经和气管的刺激4.5 从 CCA 进线，结扎 ECA 近分叉处的根部 Zea Longa从 ECA 残端进线，这种方法需要分离出一定长度的 ECA，并要切断ECA 及其分支的血流，结果会造成同侧 ECA 供血区的缺血［4 ］ ，导致血液浓缩、脑组织微循环功能下降、动物活动次数减少［5］ 在改进的模型中，只结扎 ECA 近分叉的根部，这样既可减少手术操作损伤，节省操作时间，又可通过周围血管吻合支途径在一定程度上补偿 ECA 供血区的缺血，减轻 ECA 缺血造成的损伤，提高了动物的存活率4.6 不分离 PPA PPA 是颈内动脉在颅外的惟一分支，插线过程中非常容易误插进去许多人主张分离或结扎 PPA但该分支的位置深，结扎 PPA 非常困难，操作过程对组织的损伤很大我们的改进方法不分离 PPA，只通过调整插线方向即可顺利地插进颅内，这样既减少了组织的损伤，又节省了手术时间94.7 术后围手术期间的护理极其重要动物在术后 48 h 内的死亡率最高，如果能度过这段危险期则多能长期存活术后采取了以下护理措施：将动物安置在温暖的环境中（24℃左右） ，左手托起动物，右手的四指指腹循顺时针方向轻抚动物腹部，每次进行 10 min。

随后用手指拿捏动物的足掌，用拇指揉搓动物的足掌至微发热如果术中失血较多可灌胃 2 ml 左右的温生理盐水，术后大鼠的吞咽反射差，要注意不要灌到气管里每隔 2 h 做 1 次护理，护理2~3 次后可以视动物状况适当延长护理间隔时间经过上述改进，建模成功率达到了 80%，模型更为稳定，且所需材料常见易得由于简化了手术操作步骤，一般 30 min 内即可完成一只模型本实验表明，改进的模型是成功的，值得推广。