基于rarα靶点的维甲酸诱导细胞分化和凋亡作用机制研究.pdf

浙江大学药学院 博士学位论文 基于RARα靶点的维甲酸诱导细胞分化和凋亡作用机制研究 姓名：罗沛华 申请学位级别：博士 专业：药物分析学 指导教师：程翼宇;杨波 20090601 基于R A R t x 靶点的维甲酸诱导细胞分化和凋亡作用机制研究 浙江大学药学院 博士研究生：罗沛华 导师：程翼宇教授 杨波教授 中文摘要 研究目的：维甲酸( R A ) 是一组视黄醇( 即维生素A ) 的活性分子衍生物，是目 前临床上应用最为成功的分化诱导剂，可通过与维甲酸受体特别是维甲酸受体 a l p h a ( R A R e r ) 结合，引起细胞周期蛋白依赖性激酶活化激酶( C A K ) - 9R A R t x 的解离，导致R A R t x 的低磷酸化，从而达到诱导人急性髓性白血病细胞分化或凋 亡的作用．在这一分子过程的基础上，本文进一步探讨C A K - R A R o 【_ 通路在维甲酸 诱导的骨肉瘤细胞、造血干细胞粒性分化和急性T 淋巴细胞凋亡的调控作用 研究方法：1 ) 选用人骨肉瘤细胞U 2 0 S 和M G 6 3 为研究对象，以全反式维甲酸 ( A T R A ) 处理或采用慢病毒转染法导入低磷酸化的R A R o L ，来评价A T R A 诱导的 R h R 0 t 低磷酸化与诱导骨肉瘤细胞分化之间的相关性；采用台盼兰拒染法检测活细 胞数量，并采用血细胞计数板计数来观察细胞增殖情况，描绘细胞生长曲线；细 胞经碘化丙锭( P I ) 染色后采用流式细胞术分析细胞周期的变化情况；应用R T - P C R 和W e s t e r nb l o t 检测骨肉瘤细胞分化标记基因转录水平和蛋白表达水平；采用 W e s t e r nb l o t 检测细胞周期相关蛋白C D K 7 、p 2 7 、p 2 1 的表达；结合基因芯片技术 检测R A 及外源性低磷酸化R A R 0 t 作用下人骨肉瘤细胞相关基因的变化。

2 ) 选用 人造血干细胞( H S C ) 、髓性前体细胞( C M P ) 和髓性／粒性前体细胞( G M P ) 经 R A 作用或是采用慢病毒转染法导入低磷酸化的R A R t x ，观察低磷酸化R h R 0 t 与上 述细胞分化之间的关系；应用台盼兰拒染法结合血细胞计数板计数，观察药物对 细胞增殖情况的影响；吉姆萨染色观察药物作用后细胞形态学改变；采用R T - P C R 和W e s t e r nB l o t 检测A T R A 诱导H S C ，C M P ，G M P 和人造血干细胞C D 3 4 + 细胞分 V 化的相关基因转录和蛋白表达情况；应用细胞免疫荧光检测M A T l 和C A K - 凡u № 通路相关蛋白在分化各阶段的表达；结合免疫沉淀检测分化各个阶段血细胞C A K - R A R t x 通路蛋白之间相互作用的关系3 ) 选用人急性T 淋巴M o l t 3 细胞为研究对 象，R A 作用，采用台盼兰拒染法结合血细胞计数板计数，观察其对细胞增殖情况 的影响；采用P I 染色，流式细胞术分析细胞凋亡；应用W e s t e r nb l o t 技术检测细 胞凋亡的相关蛋白e a s p a s e , - 3 、P A R P 、B C L - 2 、B A X 的表达；应用R T - P C R 和W e s t e r n b l o t 技术检测R A R t z 和p 2 1 的基因转录和蛋白表达． 研究结果：1 ) 通过台盼兰拒染法和血细胞计数板计数，显示A T R A ( 5p M ) 可显 著抑制U 2 0 S 和M G 6 3 细胞增殖．流式细胞术分析细胞周期情况，显示A T R A ( 5 “M ) 能使人骨肉瘤细胞的细胞周期阻滞在G 1 ／G 0 期．同时，通过W e s t e r nb l o t 技 术检测相关周期蛋白，发现A T R A ( 5l a M ) 能降低U 2 0 S 和M G 6 3 细胞中C D K 7 和p 2 1 的表达，引起P 2 7 的上调．该浓度的A T R A 也能诱导入骨肉瘤细胞分化标 记物O P N 的基因转录和蛋白表达增加，显示A T R A 可诱导骨肉瘤细胞分化。

通过 基因芯片比较A T R A 诱导分化细胞与空白对照细胞的基因表达谱，推测A T R A 诱 导骨肉瘤分化可能与R A R t z 、R A R [ 3 、B M P 、W N T 和F G F 蛋白有关．2 ) 通过台 盼兰拒染法和血细胞计数板计数及吉姆萨染色显示A T R A ( 1p M ) 能抑制分化各 个阶段造血干细胞H S C 、C M P 和G M P 细胞的增殖，增加三者的粒性分化通过 免疫荧光和W e s t e r nb l o t 技术确定了C A K - R A RO 【通路上p R b 、M A T l ，C D K 7 和 R A RR A R a a 在分化各个阶段造血干细胞H S C 、C M P 和G M P 细胞中的表达情况， 从中显示M A T l 的表达随着粒性分化的成熟而降解，在H S C 中表达最高、C M P 次之，G M P 最低A T R A ( 1 “M ) 诱导C M P 细胞粒性分化过程中，C D K 7 和R A R a 的表达增加，P 2 1 的表达下降，同时p R b ，C D K 7 及№的磷酸化水平都发生 下调结合免疫沉淀技术还可见A T R A ( 1p M ) 促进的C M P 和G M P 细胞粒性分 化时，可使C A K - R A R0 【复合体的解离，C M P 细胞在粒性分化过程中还伴随着 R A R ( I 和C D K 7 表达的下调，G M P 细胞则伴随着M A T l 的降解．3 ) 通过慢病毒 转染法，血细胞计数板计数，R T - P C R 和W e s t e r nB l o t 显示外源性低磷酸化的R A R ( ：t 能显著抑制人骨肉瘤细胞增殖，并能增加R A 诱导分化的能力．结合基因芯片技术， 比较了导入外源性低磷酸化＆氓0 c 所上调的基因与全反式维甲酸作用所上调的基 V l 因．导入外源性低磷酸化R A R 仅的U 2 0 S 细胞较空白对照细胞共有4 个维甲酸受 体相关通路基因显著上调．在成骨细胞分化相关通路基因中，U 2 0 S 细胞导入外源 性R A R a S 7 7 A 后有1 8 个基因显著上调，这一结果与全反式维甲酸诱导分化的人 骨肉瘤细胞相似．对细胞因子类差异基因进行生物信息学分析表明，导入外源性 R A R o 【| S 7 7 A 后有2 0 个基因显著上调。

4 ) 通过慢病毒转染法，血细胞计数板计数 及吉姆萨染色显示显示外源性低磷酸化的R A R a 能显著抑制人C D 3 4 + 细胞增殖， 并能增加A T R A 诱导分化的能力．通过R T - P C R 可见外源性低磷酸化的R A R o 【_ 增加 A T R A 诱导的C D 3 4 + 细胞中p 2 1 m R N A 的水平．5 ) 通过血细胞计数板计数可见 A T R A ( 5g M ) 显著抑制M o l t 3 细胞增殖通过台盼兰拒染法和流式细胞术可见 A T R A ( 5g M ) 处理M o l t 3 细胞在抑制细胞增殖的同时引起了细胞的死亡通过 W e s t e r nB l o t 可见A T R A ( 5t t M ) 可使c a s p a s e3 发生裂解，激活的C a s p a s e3 促进 P A R P 发生水解，产生裂解片段同时A T R A ( 5l x M ) 可以抑制M o l t 3 细胞中B C L - 2 的表达，促进B A X 的表达．通过R T - P C R 和W e s t e r nB l o t 显示P 2 1 可以被配体结 合的R A R t l 所激活从而引起细胞凋亡． 结论：通过对A T R A 在体外诱导人骨肉瘤细胞和正常造血干细胞分化过程中C A K - R A R o g 通路作用的系统研究，我们得出以下结论：1 ) A T R A5p M 可诱导骨肉瘤 细胞分化，在这一过程中C A K 和p 2 1 的蛋白水平下降，使细胞阻滞在G 1 ／G 0 期， 并使之最终走向分化．2 ) A T R A1g M 可诱导正常造血干细胞粒性分化，在这一 过程中C D K 7 和R A R t x 的表达增加，M A T l 和P 2 1 的表达下降，同时p R b ，C D K 7 及R A R o 【_ 的磷酸化水平都发生下调。

3 ) 基因芯片研究结果提示A T R A 诱导骨肉瘤 细胞分化可能与R ．A R o g 、R A R I l 、B M P 、W N T 和F G F 通路有关4 ) R A R a S 7 7 A 可以在一定程度上产生与A T R A 相似的作用，能显著抑制人骨肉瘤细胞和人 C D 3 4 + 细胞增殖，并能增加A T R A 诱导分化的能力．5 ) 筛选出的F G F 8 ，B M P 8 A 及W N T 8 B 可作进一步研究，为细胞分化的机制研究以及新的肿瘤分化诱导剂研 究提供实验依据6 ) R A R c t S 7 7 A 有助于诱导造血干细胞体外粒性分化这一研究 将为临床上体外扩增造血干细胞，诱导其粒性分化，进而治疗白血病提供实验依 据． V I I E f f e c to fR A R 0 【o nr e t i n o i da c i di n d u c e d - d i f f e r e n t i a t i o n Z h e j i a n gU n i v e r s i t yS c h o o lo fP h a r m a c e u t i c a lS c i e n c e ．．．．．．．．． C a n d i d a t ef o rP h i 2L u oP e i h u a S u p e r v i s o r P r o f ． C h e n gY i y u P r o f ．Y a n g B e A b s t r a c t O b j e c t i v e ：R e t i n o i cA c i d ( R A ) ，t h em o s tp o t e n tb i o l o g i c a l l ya c t i v em e t a b o l i t eo f v i t a m i nA ，s u p p r e s s e sp r o l i f e r a t i o nb yi n d u c i n gd i f f e r e n t i a t i o na n da p o p t o s i si nav a r i e t y o fc e l lt y p e st h r o u g hm o d i f y i n ge x p r e s s i o no fR A —t a r g e tg e n e s ．T h eb i o l o g i c a le f f e c t so f R Ao nc e l ld i f f e r e n t i a t i o no fm a l i g n a n tc e l l sa r em e d i a t e db yr e t i n o i dr e c e p t o r s ，n o t a b l y r e t i n o i ca c i dr e c e p t o ra l p h a ( R A R a ) ．T h er e c e n tf i n d i n gt h a tC A K - R A R a d i a s s o c i a t i o n ， m e ’n a g ea 、t r o。