纳米羟基磷灰石-40%二氧化锆生物陶瓷材料组织相容性评价.doc

1纳米羟基磷灰石-40%二氧化锆生物陶瓷材料组织相容性评价作者：李超　陶树清　周长林　逯代峰　荣杰生【摘要 】 ［目的］评估纳米羟基磷灰石 -二氧化锆生物陶瓷材料组织相容性 ［方法］根据 ISO10993-1 标准，采用细胞毒性试验、急性毒性试验、溶血试验和体内植入(90 d)试验对纳米羟基磷灰石-二氧化锆生物陶瓷材料组织相容性进行评估 ［结果］纳米羟基磷灰石-二氧化锆生物陶瓷材料组织相容性的细胞毒性评分小于 I 级，细胞生长无明显抑制现象，无急性毒性反应，无溶血反应，体内植入符合植入材料生物学评价要求 ［结论］纳米羟基磷灰石-二氧化锆生物陶瓷材料具有良好的组织相容性，作为骨组织工程中生物支架材料具有广阔临床应用前景 【关键词】 羟基磷灰石　二氧化锆　组织相容性Abstract: ［Objective ］To evaluate the histocompatibility of nano hydroxyapatite-zirconia composite bioceramic. ［Methods］According to the standard of ISO 10993-1,cytotoxicity experiment,acute toxicity test,hemolysis test and in vivo implantation(90 days) test were conducted to 2evaluate the histocompatibility of nano hydroxyapatite-zirconia composite bioceramic.［Results］The score of cytotoxicity experiment was lower than grade I,and there was no significant inhibition of cell growth,no acute toxic reaction or hemolytic reaction.And the in vivo implantation met the requirements of the biological evaluation of implant materials.［Conclusion］Nano hydroxyzpatie-zirconia composite bioceramic showed a good histocompatibility.It has a broad prospect as a biomaterial scaffold in the bone tissue engineering.Key words：hydroxyapatite; zirconia; histocompatibility生物陶瓷是目前骨组织工程常用的支架材料，传统的生物陶瓷材料由于粒径较大，气孔大，其脆性及弹性模量较大，影响了在生物医学领域的应用［1］ 。

由哈尔滨工业大学材料学院与哈尔滨医科大学附属第二医院骨外科共同研究制备的纳米羟基磷灰石-40%二氧化锆(nano hydroxyapatite-40%zirconia，nano HA-40%ZrO2)陶瓷材料强度、硬度、韧性和超塑性上都得到提高，如在人工器官制造，临床应用等方面将比传统陶瓷有更广泛的应用并具有极大的发展前景本研究选用细胞毒性试验、急性毒性试验、溶血试验，植入实验评价纳米 HA-40%ZrO2 组织相容性，初步评价该材料应用3于临床医学的可行性1 材料和方法1.1 材料的制备与浸提液提取HA／40%ZrO2 、 HA 由哈尔滨工业大学材料学院与哈尔滨医科大学附属第二医院骨外科共同研究制备，用溶胶-凝胶(sol-gel)法制成纳米羟墓磷灰石粉粒(HA)［2］ ，然后将质量比按 60%纳米HA+40%二氧化锆比例配制，纳米 HA 和二氧化锆粉体经充分研磨后得到纳米羟基磷灰石／二氧化锆复合粉体，采用热压低温烧结技术磨削制成 3 mm×3 mm×5 mm 长方体将经过环氧乙烷灭菌的上述复合材料以 1 g 材料／5 ml 介质的比例，放入生理盐水或小牛血中，37℃恒温箱中静置浸提 72 h 制备成 HA／40%ZrO2 浸提液，过滤除菌，4℃冰箱保存备用。

1.2 细胞毒性试验1.2.1 实验方法采用 L929 细胞(哈尔滨医科大学遗传实验室馈赠)经复苏、传代后，将细胞培养基配制 1×104 个／ml 细胞悬液分注于 96 孔塑4料培养皿中，每孔 100 μl，每组每观察期至少 8 孔，细胞培养箱内培养 24 h然后弃去原培养基，用 PBS 洗涤 2 次，试验组加入100 μl 小牛血清浸提液，阴性对照组加入 100 μl 小牛血清，阳性对照组加入 64 g/L 苯酚溶液，继续培养 1、2 d 和 3 d弃去培养皿中的浸提液和培养基，加入 20 μl/孔的 MTT 液，继续培养 6 h，吸去原液，加入 150 μl／孔二甲亚砜，振荡 10 min，在 BECKMAN DU640 紫外分光光度计以 500 nm 波长测定吸光度 OD 值，并计算细胞的相对增殖度(RGR) RGR=(试验组 OD 值-空白 OD 值)／(阴性对照组 OD 值-空白 OD 值)1.2.2 细胞毒性分级与判定RGR≥100%评为 0 级；RGR 在 75%～99%之间评为 I 级；RGR 在 50%～74%之间评为 II 级；RGR 在 25%～49%之间评为Ⅲ级；RGR 在 1%～24% 之间评为Ⅳ级；RGR 为 0 时评为 V 级)。

实验结果为 1 或 0 级反应为合格，实验结果为 Ⅱ级反应时需结合细胞形态综合评价，实验结果为Ⅲ～V 级反应为不合格1.3 急性全身毒性试验1.3.1 动物分组及实验方法5将 20 只昆明小鼠(哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心提供)，雌雄各半，体重（20±2.0 ） g，随机均分为实验组和对照组，实验组用生理盐水 HA／40%ZrO2 材料浸提液，对照组用生理盐水，均以 50 ml／kg 剂量通过小鼠腹腔注射，观察注射后24、48 和 72 h 动物的一般状态、毒性表现1.3.2 结果评定72 h 内实验组反应小于对照组为符合要求；实验组中 40%死亡，或 60%出现明显毒性反应，或动物普遍出现进行性体重下降为不符合要求1.4 溶血试验1.4.1 制备新鲜稀释血经肘前静脉抽取健康人(8 人，男性)静脉血 4 ml，混入 3.2%柠檬酸钠缓冲剂 0.4 ml，加入生理盐水 5 ml 进行稀释即制备出新鲜稀释血1.4.2 实验分组及方法6实验组取 HA／40%ZrO2 浸提液 10 ml，阴性对照组取 9 g/L 生理盐水 10 ml，阳性对照组取蒸馏水 10 ml，每组各取 8 个试管，将所有试管放入 37℃恒温箱中水浴 30 min，各试管内分别加入新鲜稀释血 0.2 ml 轻摇，37℃ 恒温保留 60 min，3 000 r/min 离心 5 min，取上清液在紫外分光光度仪上测定 545 nm 处的光吸收度(A) 。

溶血率计算公式：溶血率=(实验组吸光度-阴性对照组吸光度)／( 阳性对照组吸光度 -阴性对照组吸光度)×100%1.4.3 结果评定溶血率<5%为合格；溶血率≥5%为不合格1.5 肌肉内种植实验1.5.1 实验分组及方法选用 Wister 大鼠 40 只(哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心提供)，雌雄各半，体重（220±25 ） g，随机分为术后第7、15 、30、90 d 4 组，每组 10 只将 HA-40%ZrO2 材料块环氧乙烷消毒后备用常规麻醉消毒，在大鼠脊柱右侧 1.0 cm 处做切口，分离竖脊肌，于肌肉内植入 HA／40%ZrO2 材料块，缝合肌膜和皮肤术后每日予以青霉素 20 万 U 肌注，连续 3 d，于术后第77、15 、30、90 d 取材1.5.2 观察指标大体观察：观察术后大鼠饮食、活动、切口反应；肉眼下观察有无材料外露，材料表面的包膜形成情况、有无红肿等病理学观察：术后各时相点连同材料、包膜和样品周围 0.5～1.0 cm 厚的肌肉共同取出，常规 HE 染色，每个标本取 3 张切片在光学显微镜下观察材料周围包膜形成情况和组织反应情况1.6 统计学处理应用 SPSS 11.0 统计软件对实验数据进行统计分析，计量资料两组间均数比较采用 t 检验，多组间均数比较采用单因素方差分析。

2 结果2.1 细胞毒性试验HA／40%ZrO2 试验组及阴性对照组，随着培养时间延长，OD 值均有增加，阳性组 OD 值无增加，空白组 OD 值为 0.041实验组与阴性对照组同一时间组间比较差异无显著性(P>0.05)，8与阳性对照组比较差异有显著性(P<0.01)HA／40%ZrO2 小牛血清浸提液对 L929 细胞的细胞毒性均为 1 级( 表 1)，符合国家医用生物材料细胞毒性要求［2］ 2.2 急性全身毒性实验实验小鼠均无死亡、进食正常，无惊厥、呼吸抑制、腹泻、运动减少和体重下降等不良反应，评价属无毒级组间小鼠体重增加量比较差异无显著性(P>0.05)，小鼠体重增加量见表 2表 1 细胞毒性实验各组 OD 值，RGR 和细胞毒性分级分组培养 24 hOD值 RGR（略）2.3 溶血实验HA／40%ZrO2 浸提液组吸光度为 0.040±0.003，阴性对照组吸光度为 0.009±0.001，阳性对照组吸光度为 0.988±0.031，根据溶血率公式计算 HA-40%ZrO2 材料浸提液的溶血率为 3.17%，溶血率<5% ，符合溶血实验要求2.4 肌肉内植入实验2.4.1 大体观察9各组实验动物术后当天开始进食且活动正常，创口无明显出血、渗出，术后 5 d 创口愈合良好。

未见皮肤破溃、植入物外露等现象将包绕 HA-40%ZrO2 材料的组织切开，术后第 7、15 d 时无明显包膜形成，第 30、90 d 时可见包膜组织，包膜随时间延长逐渐变薄表 2 急性全身毒性实验体重变化情况（略）2.4.2 组织病理学检查材料植入大鼠竖脊肌植入后 7 d，试样周围可见以嗜中性粒细胞浸润为主的炎性反应，可见吞噬细胞，无囊壁形成（图 1） ；植入 15 d 后试样周围有少量嗜中性粒细胞、淋巴细胞浸润和巨细胞；试样周围可见小血管与纤维母细胞增生，开始形成疏松囊壁（图 2） ；植入 30 d 后，试样周围可见少量淋巴细胞，试样周围可见纤维母细胞与胶原纤维，并已形成纤维囊腔结构（图 3） ；植入 90 d 后试样周围未见或仅见极少量淋巴细胞，纤维化囊壁致密，壁的厚度比形成初期要薄（图 4） 3 讨论生物陶瓷是目前骨组织工程常用的支架材料，常用的是以羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA) 粉料为原料［2］ ，经高温烧结即得10到的生物羟基磷灰石陶瓷，由于其粒径较大，气孔大，其脆性及弹性模量较大，影响了在生物医学领域的应用［3］ 纳米生物复合材料是将纳米微粒与其他材料复合制成各种复合材料从而获得许多优良特征［4］ 。

氧化锆(ZrO2) 具有良好的耐磨性、抗生理腐蚀性和好的生物相容性，而且其强度、断裂韧性指标也高于其他所有的生物陶瓷材料，作为第二相颗粒加入到 HA 涂层中可以显著提高涂层材料的力学性能 ［5］ 目前国内外已制备出含有(10%～70%)ZrO2的纳米羟基磷灰石复合材料［6］ ，其强度和韧性等综合性能可达到甚至超过致密骨骼的相应性能［7、8 ］ 其 ZrO2 含量越高其力学性能提高越明显，但由于金属离子效应，吸附在材料表面的组织生物分子的化学组成将会发生相应的变化为探索在力学性能和组织相容性上达到平衡，由哈尔滨工业大学材料学院与哈尔滨医科大学附属第二医院骨外科共同研究制备成 HA／40%ZrO2，其在强度、硬度和韧性上都。