TTX免疫组化相关知识.doc

免疫组织化学(Immunohisochemistry)检测技术曾被公认为病理学发展史上的第二个里程 碑，此项技术发展到今天，大大充实了病理学的内容，使病理诊断结果更精确，将病理学 提高到了形态和功能相结合的水平免疫组织化学方法的敏感性和特异性直接影响诊断结果 的准确性近两年來，在本科同志的配合下，笔者己做免疫组化420例，取得了很好的效 果，并且明显的提高了诊断结果的准确性，支持了对临床病人的治疗现提出以下五点供同 道借鉴1固定病理组织的固定，在以往的工作中体会到，一定要在中性10%福尔马林(pH7.2〜7.4) 溶液中进行充分的固定，因为组织固定的好坏，直接影响切片染色的效果如果固定不完全 或固定不充分，不仅影响组织结构的显示，还会造成细胞抗原的丢失，一般最好在标本手术 切下半小时内，以10%中性福尔马林溶液(pH7.2〜7.4)中固定组织，固定时间不低于12 h,固定液不少于组织体积的4〜10倍，普通的福尔马林固定液和其他固定液不利于抗原的 保存，最好不用我科现在用的中性缓冲溶液(pH:7.4)效果很好，其配制方法如下:欲配 制5000ml、0.01 M、pH7.4中性福尔马林缓冲液，先配制0.01 M、pH7.4PBS缓冲液，A:0. 2M NaH 2 PO 4 -2H 2 O (MW156.01),称取 15.6g NaH 2 PO 4 -2H 2 O 溶于 50 0ml 蒸憾水中;B:0.2M Na 2 HPO 4 -12H 2 O (MW358.14),称取 35.8g Na 2 HPO 4 -12H 2 O溶于500ml蒸憾水中。

取A液42.7ml, B液182.25ml,两液混合加蒸憾水至 4500ml,最后加入40%福尔马林溶液500ml即可2载玻片的预处理免疫组织化学染色所用的载坡片需做防脱片处理目前，最常用的是多聚丄■赖氨酸防 脱水剂玻片处理方法如下:首先将玻片清洗干净，用重珞酸钾清洗液浸泡洗涤玻片，再用 无水酒精做脱酯处理，用自来水、蒸镭水冲洗，自然晾干，也可放在60°C烤箱中烤干将 洁净、干燥的载玻片浸泡在稀释后的多聚赖氨酸防脱水剂溶液中，浸泡时间为5min,取出 烤干即可这样处理后的载玻片在免疫组化染色中不易掉片，尤其是在微波加热修复时， 并且不影响染色效果，大大减少了染色过程中掉片所造成的损失3组织片的处理石蜡切片厚4〜6pm,捞片于多聚赖氨酸防脱水剂中，60°C烘烤30min〜60min,再脱 蜡、脱水这个处理过程的关键是要保证梯度二甲苯和酒精的浓度，使组织脱蜡、脱水干净 彻底，否则，水洗后切片含有“油珠”，呈云雾状，冲洗不干净，致使抗体在组织上分布不均， 导致染色效果不佳我科的方法是:普通常规染色所用的梯度二甲苯和酒精与免疫组织化学 染色所用的梯度二甲苯和酒精分开，并且定期更换液体在二甲苯脱蜡吋，二甲苯I和II 脱蜡时间不少于半小时，梯度酒精各5min左右。

如在室温较低时，应将梯度二甲苯放于恒 温箱中提前预热，梯度酒精时I'可延长，保证组织的充分脱蜡脱水4组织抗原的修复rti于目前所进行的常规石蜡切片标本均用甲醛固定，使抗原性物质市于形成醛键、竣甲 键等原因而被封闭了部分抗原决定簇，或者由于蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐藏，因 此，在染色时，有些抗原需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破 坏，恢复抗原的原有空间形态目前组织抗原的修复方法有两类，即酶消化和热修复4.1酶消化法 常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶，应严格学握好消化时间、温度和 浓度胰蛋白酶使用浓度为0.05%〜0.1%,消化温度为37°C,消化时间为10〜40min,主 要用于细胞内抗原的显示:胃蛋白酶使用浓度为0.4%,消化温度为37°C,消化时间为30〜 180min,主要用于细胞间质抗原的显示，女□:Laminin （层粘蛋白），Collagen IV （IV型胶 原蛋白）等4.2热修复法 现常用微波修攵、高温高压修攵、水浴加热修攵法最常用的修攵法是 pH6.0枸橡酸缓冲液修复过程中的注意要点是：（1）达到规定的温度（92°C〜95°C以上）；（2）维持一定的时I'可，微波修复、水浴加热须控制在10〜15min,高温高压修复须控制在 2min左右；（3）避免切片干涸，如果切片干涸，抗原则可能完全丢失；（4）加热后必须经 过室温自然冷却20〜30min,使未折叠的蛋白分子链恢复天然构型。

5切片的显色非特异性染色的免疫组织化学检测工作中很关键的步骤之一，染色的好坏直接影响免疫 组化的检测结果，主要原因有以下几点5.1是否有效的祛除了内源性酶和生物素应注意的是，并不是每一种组织均需要祛除 内源性酶和生物素，但对于内源性酶和生物素含量丰富的组织如肝脏、肾脏等，如染色效果 不佳，均考虑此原因处理方法为：（1）灭活碱性磷酸酶:最常用的方法是将左旋咪哮（24 mg/ml）加入底物液中，并保持pH值在7.6〜8.2 Z间，即能祛除大部分内源性碱性磷酸酶, 对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸抑制；（2）饱和处理内源性生物 素:消除内源性生物素的方法是事先滴加亲和素以饱和内源性生物素，使之不再有剩余的结 合位点，具体操作是在ABC法或SP法染色前•将切片浸于25pg/ml亲和素溶液中处理15m in, PBS清洗15min即可染色5.2是否选择使用了正确的封闭血清要消除电荷吸附所造成的非特异性背景染色，可 用二抗动物的非免疫血清，用PBS稀释为3%〜10%的溶液，以次溶液孵育切片，以封闭 吸附位点5.3所选择的抗体是否符合实验要求因为抗原不纯，标本中含有与靶抗原相似的抗原 决定簇等原因造成的非特异性染色，只能通过采用高纯度、高效价的抗体，或者针对更具特 异性抗原决定簇的单克降抗体来解决。

5.4清洗是否充分应严格掌握操作规程，因为在缓冲液中含有一定量的盐，这也有利 于减低背景着色，通常0.05mol/L tris HCL0.15mol/L NaCI已适用于多数染色方法，溶液 中加入吐温20,效果更佳5.5 DAB的使用是否正确DAB的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜色，使用浓 缩型DAB试剂盒时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸馆水的pH值， 以确保实验结果的正确性;粉剂DAB溶解时，常有一些不溶性颗粒，这些颗粒须经过滤除去, 否则可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色另外DAB保存不妥产生氧化物亦可沉积于 切片上，因此须将DAB保存于避光干燥处，现用现配，临用前加H 2 0孵育时间过长也 会造成背景着色5.6标本染色过程中是否曾经干涸如有干涸，会造成边缘部的非特异性染色5.7检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应免疫组织化学染色的成功与 否，以上几点都是关键因素，免疫组化染色过程繁琐，历吋较长，这就要求每一步都要严格 操作，如果掌握不好，在染色过程中会出现组织掀起、掉片、背景过深，出现假阳性、假阴 性等现象，最终不能得到检测结果，如果能够严格掌握好每一步，定能做出优质切片。

5.8其它一抗的使用浓度是否过高。