生物介质中MN9202检测方法的建立及其应用.doc

1生物介质中 MN9202 检测方法的建立及其 应用作者：冉玉华，周四元，刘新友，滕增辉，杨润涛，杨志福，梅其炳【关键词】 MN9202；反相高效液相色谱；生物介质Establishment of a method of determining MN9202 in biomedium and its application【Abstract】 AIM: To establish a method to determine 2,6Dimethyl4(3nitropheny1)1,4 dihydropyridine3carboxylic acid dimethylester5carboxylic acid pentyl ester (MN9202) in biological medium by reversephase highperformance liquid chromatography (RTHPLC). METHODS: The specimen containing the lysate of Caco2 cells and rat plasma were extracted with ether. The organic phase was removed into the tubes and then evaporated in ventilation cabinet. The residue was dissolved in 50 μL of methanol, then 20 μL solution was drawn and detected by RTHPLC. RESULTS: MN9202 could be disassociated from interference in the certain mobile phrases, the regression equation of the standard curve to detect the cell samples was Y=0.0048X+0.0592, r=0.9997, n=7 (P0.01), the linear range was 20-500 mg/L; The standard curve to detect MN9202 in the plasma was worked out, and the regression equation was Y=0.0058X+0.1468, r=0.9998, n=7 (P0.01), the linear range was 20-500 mg/L. CONCLUSION: The analytical method was convenient, stable, sensitive and accurate. It could be applied to the determination of MN9202 in biological medium.【Keywords】 MN9202; RPHPLC; biomedium【摘要】 目的：建立生物介质中 1，4 二氢 2，6 二甲基 4(3 硝基苯基)3，5 吡啶二甲酸甲戊酯（MN9202）的高效液相色谱检测方法. 方法：分别以细胞和大鼠血浆作为生物样本，用乙醚对含药 Caco2 细胞裂解液及血浆样品进行预处理，用反相高效液相色谱法分析生物样本中的原形药物的浓度. 结果：在选定的色谱条件下，MN9202 和干扰物质能够实现较好的分离，测定细胞样品的工作曲线回归方程为2Y=0.0048X+0.0592,r=0.9997，n=7 (P0.01)，线性范围为 20~500 mg/L. 测定血浆样品的工作曲线回归方程为 Y=0.0058X+0.1468，r=0.9998,n=7(P0.01),线性范围为 20~500 mg/L. 结论：所建立的分析方法简便、稳定、灵敏、准确，可用于生物介质中 MN9202 的浓度检测.【关键词】 MN9202；反相高效液相色谱；生物介质0 引言1，4 二氢 2，6 二甲基 4(3 硝基苯基)3，5 吡啶二甲酸甲戊酯（MN9202）是一种二氢吡啶类钙离子阻滞剂，也是目前研究报道的具有较好的药理效应的二氢吡啶类药物之一. MN9202 具有明显的扩血管效应，其作用与其抑制电压依赖性钙通道，减少 Ca2+内流有关. MN9202 也具有对抗血小板聚集诱导剂角叉菜胶引起血栓的作用，作用机制可能与共抑制红细胞，血小板聚集，保护血管内皮，舒张痉挛血管有关［1］. 二氢吡啶类药物口服剂量小、有效血药浓度低，目前国内外所用的检测方法包括 LC,LCMS 等，为了有效检测其血药浓度及便于进行相关的研究，必须建立灵敏度较高的检测方法. 我们通过优化色谱条件，选择具有强吸收的237 nm 处作为二氢吡啶类药物的检测波长，从而提高了灵敏度，可用于生物介质中 MN9202 的浓度检测.1 材料和方法1.1 材料选用大鼠血浆作为生物介质之一［2］，大鼠［（200±15) g］由第四军医大学实验动物中心提供. 实验中选用的另外一种生物介质是 Caco2 细胞，它来源于人结肠癌细胞，在体外培养条件下，能够分化形成单层的细胞的膜，与小肠上皮细胞结构和生理状况相似，是目前国内外公认的体外药代动力学研究的理想模型3［3］. Caco2 细胞接种于 24 孔板（Costar，美国），培养 10~14 d，用于实验［4］. 高效液相色谱仪（美国 Beckman 公司），高速离心机(日本 Hitachi CR21F)，色谱分析柱为 C18 柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm, phenomenex). MN9202 和 MN9203(内标)为本教研室合成，纯度大于 98%，乙腈(色谱纯，TEDIA 公司)，甲醇（色谱纯，TEDIA公司），碱化液 50 mmol/L 的磷酸氢二钠(用 NaOH 调节 pH 到 12)，其他试剂均为分析纯.1.2 方法1.2.1 色谱条件色谱分析柱为 C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，phenomenex),流动相：乙腈/水（82/18,V/V），流速:1 mL/min，检测波长为 237 nm.1.2.2 生物样品预处理①细胞给药后反复冻融成为细胞裂解液；取 0.5 m L 细胞裂解液（其中药物的浓度为 500 mg/L），加入 0.1 mL 的 MN9203（内标，终浓度为 200 mg/L），再加入 1 mL 的碱化液，用 1 mL 的乙醚提取两次，收集提取液于尖底试管中，于通风橱中由空气流自然挥干. 残留物用 50 μL 的甲醇溶解后进行高效液相分析. ②大鼠腹腔静脉取血，肝素抗凝，离心得血浆［5］. 取 0.5 mL 血浆，加入 0.5 mL 含有内标的药物（药物浓度和内标的浓度分别为 500 mg/L 和 200 mg/L）,混匀，其余步骤同①.1.2.3 分析方法培育 10~14 d 的 Caco2 细胞，呈单层细胞膜的形式，可以用于药物的摄取实验. 将 MN9202 配制成一定的浓度，在每孔细胞上加入相同体积的药物，并将药物与细胞一起孵育 5，10，20，30，40，60 min，弃去培养液，用 PBS 冲洗细胞 3 次，细胞反复冻融成为细胞裂解液，用 1.2.2 中的方法分析细胞裂解液中药物的浓度，观察 Caco2 细胞对药物的摄取情况. 2 结果42.1 提取溶剂的选择选用乙醚作为提取溶剂，对细胞和血浆等生物样本中药物，具有提取率高，挥发速度快，杂质干扰较少的优点［4］.2.2 流动相和检测波长选用药物具有强吸收的 237 nm 作为检测波长，将曾用的甲醇和水优化设计成乙腈和水（82/18，V/V）为流动相. 干扰物质，内标以及药物能够实现基线分离,见色谱图.2.3 工作曲线回归方程、线性范围以 MN9202 与内标（MN9203）的峰面积比为纵坐标，以 MN9202 的浓度为横坐标制作工作曲线. 应用 Excel 软件采用最小二乘法得到细胞样品的工作曲线回归方程：Y=0.0048X+0.0592,r=0.9997，n=7(P0.01),线性范围为 20~500 mg/L；测定血浆样品的工作曲线回归方程（方法同上）：Y=0.0058X+0.1468,r=0.9998,n=7(P0.01), 线性范围为 20~500 mg/L.2.4 回收率和精密度当细胞中的 MN9202 的浓度为 20,100,500 mg/L 的时候，方法回收率分别为（94.75±7.03）%,（100.35±2.97）%和（107.20±5.01）%. 其日间精密度 RSD 为 11.28%，6.25%，9.23%；日内精密度 RSD 为14.09%，4.62%，3.22%（P0.01）. 当血浆中的 MN9202 的浓度为 20,100,500 mg/L 的时，方法的回收率为（88.75±9.82）%,（98.09±8.58）%,（98.26±6.22）%,其日间精密度 RSD 为 13.65%,5.88%,3.89%（P0.01）；日内精密度 RSD 为11.40%,4.64%,3.89%（P0.01，图 1）.a:MN9202 出峰，b:MN9203 出峰. ①空白细胞；②不含内标的标准品；（MN9202）；③测定细胞样本 MN9202；④大鼠血浆浆样本 MN9202 测定.5图 1 测定不同生物样本中 MN9202（略）2.5 不同孵育时间下 MN9202 在 Caco2 细胞中的摄取 Caco2 细胞对药物的摄取表明，MN9202 在胃肠道容易被吸收，但其首过效应显著，从而可能对其生物利用度产生影响（图 2）.图 2MN9202 在 Caco2 细胞中的摄取（略）3 讨论选择细胞中 MN9202 的提取方法时，参考了文献所报道过的血浆中药物的提取方法［3］，因为细胞和血浆样本均存在着成分复杂，干扰较多的特点，故对细胞和血浆中的样品的提取是在分别比较了乙酸乙酯、正丁醇、甲基叔丁醚、环己烷等提取样品的情况，得出应用环己烷和正丁醇提取，所得提取液不容易挥干；用乙酸乙酯和甲基叔丁醚提取，提取溶剂中杂质太多，干扰样品的测定［2］. 本文选用了乙醚作为提取溶剂，对细胞和血浆等生物样本中药物，具有提取率高，挥发速度快，杂质干扰较少的优点.二氢吡啶类药物在用分光光度计进行扫描时发现它在 237 nm 和 350 nm 两个波长处均存在吸收现象，并且在 237 nm 波长处吸收更强. 在本实验条件下，237 nm 处的吸光度值几乎为 350 nm 处吸光度值的 4 倍，但血浆内源性物质等对测定有明显干扰，以往的实验都选择 350 nm 作为检测波长，但是对于药物含量较低的生物样本而言，采用以往的方法无法实现在 350 nm 处的信号检测. 本实验选用药物具有强吸收的 237 nm 作为检测波长，提高了检测方法的灵敏度. 将流动相优化设计为乙腈和水（82/18，V/V）. 实现了干扰物质、内标以及药物的基线分离.6本文建立的测定生物介质中 MN9202 的 RPHPLC 方法，经回收率、精密度及标准曲线考察，表明此分析方法具有灵敏、准确、迅速的特点. 与以往对于该类药物的检测方法相比，具有明显的优点，可用于生物介质中 MN9202 的测定及该类药物的药代动力学研究.【参考文献】［1］ 弥曼，胡玉珍，张庆红,等. 钙通道阻滞剂 MN9202 对家兔血流动力学的影响［J］. 心脏杂志，2005,17（2）:106-108.［2］ 杨志福，周四元，杨铁虹,等. 间硝苯地平在 Beagle 犬体内的药代动力学［J］. 药学学报, 2004,39(8): 609-613.［3］ During A, Harrison EH. Intestinal absorption and metabolism of carotenoids: insights from cell cultu。