红光照射对创伤愈合的影响.doc

1红光照射对创伤愈合的影响【摘要】 目的： 建立双抗体夹心 ABC ELISA 法，研究红光照射对创伤愈合的作用机制. 方法： 40 名受使者随机分为 4 组，每组 10 人，A 组：20 mW/cm2；B 组：30 mW/cm2；C 组：40 mW/cm2；D 组：对照组. 红光照射 45 min/次，1 次/d，连续10 d，采用双抗体夹心 ABC ELISA 法测定受试者VEGF，PDGF，TGF β1，bFGF 含量变化情况. 结果： 双抗体夹心 ABC ELISA法检测 VEGF，PDGF，TGF β1，bFGF 具有很好的特异性，红光照射组VEGF，PDGF，TGF β1，bFGF 含量高于对照组（P0.05），在 30 mW/cm2 红光照射时，bFGF 含量最高. 结论： 红光照射加快创伤愈合与促进VEGF，PDGF，TGF β1，bFGF 分泌有关，有利于临床推广应用. 【关键词】 红光 创伤愈合 双抗体夹心法 酶联免疫吸附实验0 引言红光是指波长 600~700 nm，可以对生物体产生光化学作用的光线. 红光可直接作用于血管、淋巴管、神经末梢和皮下组织等而发挥着相应的治疗作用. 近年来有关红光的临床研究正越来越多被人们认识和重视. Reddy 等［1］应用红光照射糖尿病小鼠的实验研究中发现，632 nm 的红光可以使照射组小鼠的伤口愈合强度、拉力、负重力和坚韧度比对照组明显提高，总胶原浓度也明显升高. Schindl 等［2］应用红光照射不同原因导致的难治性溃疡患者，所有患者的溃疡在足够的照射后均能愈合，且无明显毒副作用. 我们采用双抗体夹心法（ABC ELISA）测定了红光照射对 40 名志愿者血管内皮细胞生长因子（VEGF），血小板衍生生长因子（PDGF），转化生长因子（TGF β1），碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）含量的影响，2进一步从分子生物学角度证实红光对软组织创伤及伤口愈合的影响，为红光照射治疗软组织创伤及伤口愈合适应症提供了理论依据.1 材料和方法1.1 材料 2006 09/2007 08 选取本院 40 名志愿者，无光过敏史及近期服用光过敏剂者；无慢性溶血，出凝血功能异常者和无明显出血倾向者及卟啉病者. 将40 名志愿者随机分为 4 组，每组 10 人. A 组：20 mW/cm2；B 组：30 mW/cm2；C 组：40 mW/cm2；D 组：对照组. 红光照射组照射 1 次/d，每次 45 min，10 次，对照组用日光灯照射，照射时间、次数和实验组相同. VEGF，PDGF，TGF β1，bFGF 标准品和单克隆抗体，生物素标记的 VEGF，PDGF，TGF β1，bFGF 单抗均由本实验室制备；辣根过氧化物酶标记 Streptavidin（华美生物技术有限公司）；预包被的 96孔微孔检测板（Pierce 公司）；显色酶底物 OPD(Sigma 公司)，紫外分光光度计（Amersham 公司），680 型酶标仪（BioRad 公司），HG 675 型红光治疗机（深圳一体智能技术有限公司），受试人血样 40 份.1.2 方法1.2.1 样本采集受试者采集全血 5 mL，不加抗凝剂，直接分离血清，放置-20℃冰箱备用.1.2.2VEGF，PDGF，TGF β1，bFGF 含量的测定将 450 μL 样本稀释液加入到1.5 mL 进口聚丙烯管中，再加入 10 μL 血清样本，加入 20 μL(1 mol/L) HCL，2～8℃放置 60 min，后再加入 20 μL(1 mol/L) NaOH，上下混匀既用或放置-20℃冰箱备用. 单克隆抗体的生物素化标记方法，参照常规方法［4-5］. 双抗体夹心 ABC ELISA 法测定 VEGF，PDGF，TGF β1，bFGF 含量，在配置好的标准溶3液中各加入 25 μL 待测试样品，充分混匀，37℃孵育 30 min，洗涤液洗涤；加入生物素化抗体 50 μL，充分混匀，37℃孵育 30 min，洗涤液洗涤；加入辣根过氧化物酶标记 Streptavidin 液 100 μL，充分混匀，37℃孵育 60 min，洗涤；后再加入酶底物 OPD 100 μL，37℃暗处反应 5～10 min，使底物显色；最后加入 2 mol/L 硫酸 50 μL，终止反应. 在 BioRad680 型酶标仪上测量吸光度（A492 nm）值.统计学处理：计量数据以 x±s 表示，应用 SPSS11.0 统计软件进行统计学分析，统计方法采用方差分析及 Dunnett t 检验.2 结果2.1ABC ELISA 法标准曲线的建立以制备的各生长因子标准浓度为横坐标，以吸光度（A492 nm）值为纵坐标作图（图 1），当 VEGF(系列 1)浓度为 32～2000 pg/mL,bFGF(系列 3)浓度为 16～500 pg/mL 之间时，检测生长因子的浓度与其吸光度（A492 nm）值之间线性关系良好. 进行回归分析，建立 ABC ELISA 法测定生长因子的标准曲线（图 2）并得到直线回归方程 y=0.34x-0.27，当待测品在以上各浓度范围时，对数和吸光度（A492 nm）值呈线性关系.2.2 灵敏度和稳定性实验在上述各浓度范围内，VEGF，PDGF，TGF β1，bFGF检测限分别为 50, 15.6, 32, 16 pg/mL，选择生长因子不同浓度重复测定，得出批内差异分别为 3.96%,6.28%,7.29%,6.83%. 图 1VEGF，PDGF，bFGF 浓度与吸光度值的关系（略）图 2ABC ELISA 法检测 VEGF，PDGF，bFGF 工作曲线（略）42.3 特异性检测用建立的 ABC ELISA 法测定，吸光度（A492 nm）值与阴性值接近，表明该法检测生长因子具有很好的特异性.2.4 红光照射人体 VEGF，PDGF，TGF β1，bFGF 含量比较根据各样品 A492 nm 值在标准曲线上分别计算出相应人体 VEGF，PDGF，TGF β1，bFGF 的含量，其中 TGF β1 实际浓度（ng）＝测量浓度×稀释倍数 50/1000，数据表明红光照射组（A，B，C 组）VEGF，PDGF，TGF β1，bFGF 的含量与随机对照组（D 组）存在统计学差异，TGF β1 在照射剂量为 30 mW/cm2 作用时分泌较其他剂量组明显(表1).表 1 红光照射对人体生长因子含量的影响（略）aP0.05 vs 对照.3 讨论红光是指通过物理学方法，将大部分其他光线滤去，包括滤去对皮肤有损害作用的紫外线和具有明显热效应的红外线部分，仅保留 600～700 nm 波段的光. 红光对人体穿透性较强，穿透深度可达 30 mm 以上，可以作为一种局部或全身的治疗手段应用于临床，发挥其多种生物学效应［6］. 动物试验证明，红光照射可增强实验动物线粒体过氧化氢酶活性，提高细胞新陈代谢水平，使糖原、蛋白生物合成增加，促进细胞合成和伤口愈合［1］.创伤性疾病与受损伤部位血管数量减少密切相关，创伤部位血管修复是一个复杂的生理过程，它是由许多细胞因子及生长因子通过直接或间接方式调节支配，其中血管内皮细胞生长因子（VEGF）是一种最直接的促进血管生成的多功能的细5胞因子，其作用贯穿创伤组织再生修复的病理生理过程，同时 VEGF 是多种细胞因子诱导创伤血管生成的重要中介因子［7］. 实验表明：与对照组相比，红光照射后血管内皮细胞生长因子（VEGF），血小板衍生生长因子（PDGF），转化生长因子（TGF β1）分泌明显增加，并且与红光照射剂量呈现一定剂量依赖关系，即随照射剂量增加而增强，进一步表明 PDGF，TGF β1 可以通过促进 VEGF 的分泌合成，间接加速创伤组织血管内皮细胞增值，对血管生成和创伤修复至关重要.体外实验证明，人体碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）本身既是强有力的血管生成刺激剂，又是细胞迁移和增值的调节剂，bFGF 具有促进创伤部位血管生成和早期肉芽组织形成等多种生物学效应，同时 bFGF 又是成纤维细胞内皮细胞强大的促分裂原和趋化因子［7-8］，对人体 VEGF 的表达有明显的促进作用，成纤维细胞是参与伤口上皮化和愈合的重要细胞，实验发现红光照射后 bFGF 与对照组相比分泌明显增加，并且红光照射剂量与 bFGF 分泌呈非线性关系，在照射剂量为30 mW/cm2 作用时较明显，表明红光照射加快创伤愈合与促进 bFGF 分泌增加密切相关.实验过程中未见红光受试者出现明显不良反应，说明了红光照射对于人体无明显毒副作用，值得临床推广应用.【参考文献】［1］ Reddy GK, Stehno Bittel L, Enwemeka CS. Laser photo stimulation accelerates wound healing in diabetic rats［J］. Wound Repair Regen，2001，9：248-255.［2］ Schindl M， Kerschan K， Schindl A， et al. Induction of complete wound healing in recalcitrant ulcers by low intensity irradiation depends on ulcer cause and size［J］. Photoimmunol Photomed，1999，15：18-21.［3］ 贾丹民，李乃民，唐立民，等. 红光照射对人体抗疲劳能力的影响［J］. 解6放军医学杂志，2007，32（10）:1086-1088.［4］ 李成文. 现代免疫化学技术［M］. 上海：上海科学技术出版社，1990：79-101.［5］ 徐宜. 免疫检测技术［M］. 北京：科学技术出版社，1997：271-289.［6］ Yaakobi T， Maltz L， Oron U. Promotion of bone repair in the cortical bone of the tibia in rats by low energy laser（He Ne）irradiation［J］. Calcif Tissue Int，1996，59：297-300.［7］ Schindl A， Schindl M， Schon P， et al. Red light laser therapy: A review［J］. Invest Med，2000，48(3)：312-326.［8］ Schindl A， Merwald H， Schind L， et al. Direct stimulatory effect of low intensity 670 nm laser irradiation on human endothelial cell proliferation［J］. Br Dermatol，2003，148：334-336.。