MTBE对大鼠中枢神经系统Fos蛋白的影响临床医学论文.doc

MTBE对大鼠中枢神经系统Fos蛋白的影响_临床医学论文 作者：李素云，贺性鹏，熊伟，万炜，邓学良，曾怀才，李程 【摘要】 目的 通过研究甲基叔丁基醚(MTBE)对大鼠中枢神经系统Fos蛋白的影响，探讨MTBE对中枢神经系统急性毒作用部位方法 54只健康成年SD大鼠，体重180～220g，随机分为9组，腹腔注射MTBE原液染毒，以未染毒为对照，染毒剂量分别为700、1050、1400mg/（kg·bw），染毒后用免疫组织化学方法检测Fos蛋白的表达并用相对灰度值定量结果 未染毒对照组脑组织神经元内仅有少量Fos蛋白表达，MTBE急性染毒后在大脑皮质、丘脑、下丘脑、小脑皮质神经元内Fos蛋白表达均有明显增多，Fos蛋白表达的相对灰度值随着MTBE染毒剂量的增加，其表达逐渐增强，其中MTBE对大脑皮质、小脑皮质的毒作用较丘脑、下丘脑更为明显；各部位Fos蛋白在MTBE染毒后0.5h时表达开始增加，1.0h达到高峰，2.0h时开始减弱，8.0h时Fos蛋白表达恢复到染毒前水平结论 MTBE可诱导大脑皮质、小脑皮质、丘脑和下丘脑Fos蛋白的表达增强，大脑皮质、小脑皮质、丘脑和下丘脑是MTBE的急性毒作用部位。

【关键词】 甲基叔丁基醚；Fos蛋白；中枢神经系统；动物实验，大鼠　　Abstract: Objective To investigate the effects of methyl tertiary butyl ether (MTBE) on the FOS protein in central nervous system of the rats. Methods 54 SD healthy adult-rats weighed 180～220g were involved in this study. They were randomly divided into 9 groups and were given intr-abdominal MTBE injection. The MTBE exposure dosages were 700, 1050, and 1400mg/(kg·bw). After the rats were exposed to MTBE, an immunohistochemical method was used to detect the FOS protein levels and the Gray-value was determined. The control group was given normal saline. Results Less Fos protein expression was found in the control group. After exposed to MTBE, an acutely elevated Fos protein level in cerebral cortex, thalamus and cerebellar cortex neurons were found. An relative Gray-value was intensified as the increasing of Fos protein. The toxic target sites in cerebral cortex and cerebellar cortex were more clear than those thalamus and hypothalamus. The Fos expression in each sites were elevated 0.5 hour after MTBE exposure, the peak expression was found at 1.0 hour, a diminishing level was found at 2.0 hour, and the Fos protein level returned to the levels before MTBE exposure at 8 h. Conclusion The elevated Fos protein in cerebral cortex, cerebellar cortex and hypothalamus can be induced by MTBE, the acute toxic target sites of MTBE are cerebral cortex, cerebellar cortex and hypothalamus.　　Key words: methyl tertiary butyl ether; Fos protein; central nervous system; animal experiments, rats甲基叔丁基醚（Methyl Tertiary Butyl Ether, MTBE）作为无铅汽油添加剂，可提高汽油燃烧率，增加辛烷值，减少机动车辆尾气CO及其它有害物的排放，并替代四乙基铅作为汽油抗爆剂［1］。

目前国内外的研究结果显示，MTBE可对实验动物和人群的不同组织、器官和系统具有一定的毒作用［2,3］实验动物研究和人群调查显示［4］，MTBE对中枢神经系统具有明显抑制毒作用，但其毒作用机制和中枢神经靶部位尚不清楚本实验通过MTBE急性染毒，应用免疫组织化学方法检测脑组织各部位中Fos蛋白的表达，研究MTBE对脑组织的急性毒作用损伤部位，为进一步探讨MTBE对中枢神经系统脑组织急性毒作用机制提供实验依据　　1 材料与方法 　　1.1 试剂与仪器 　　MTBE(湖南长岭炼油厂)，纯度为98.7%Ⅰ抗为兔抗鼠Fos IgG多克隆抗体（1∶500）(美国Sigma公司生产)Ⅱ抗为生物化羊抗兔（1∶200）（北京中山生物有限公司生产）生物素—卵白素—辣根过氧化物酶复合物ABC液（1∶200）（美国Sigma公司生产）小牛血清（北京中山生物有限公司产品）Motic5000型荧光显微镜（美国Motic company产品） 图像分析系统(motic images advanced 3.2，美国Motic company生产)恒低温切片机(Therdo electron company产品)SD大鼠（中南大学实验动物部生产）。

　　1.2 动物中毒模型的建立　　成年SD大鼠54只，体重180～220g，随机分为9组，每组6只，雌雄各半MTBE染毒途径为腹腔注射原液，MTBE染毒分三个剂量组，各组剂量分别为700、1050、1400mg/（kg·bw），其中1050mg/（kg·bw）MTBE染毒实验组设置染毒后0.5、1.0、2.0、4.0、8.0h五个不同时间，另设一个对照组，对照组注射生理盐水1400mg/（kg·bw）　　1.3 脑组织的固定和切片　　待实验动物MTBE染毒后1h后，实验组和对照组分别用质量分数为10%水合氯醛［0.2ml/（50g·bw）］处理，将实验大鼠取仰卧位固定于手术台上，剪开腹壁，暴露膈肌，小心剪破膈肌，然后向上剪破胸壁与心包，暴露心脏用灌注穿刺针沿着心脏的纵轴方向经心尖刺入左心室至升主动脉根部，止血钳固定，在右心耳剪一小口，可见血液流出，先用温生理盐水50 ml灌注，待右心耳流出的液体变清亮时，再用4℃预冷的质量分数为4%的多聚甲醛磷酸缓冲液（0.1 mol/L PBS，pH＝7.4）150～200ml灌注，一般灌注时间不少于30min灌注完成后，取出脑组织标本，在4℃预冷的质量分数4%的0.1 mol/L PBS(pH=7.4)中固定2～4h后，分别置于质量分数为15%和30%的蔗糖（0.1mol/L PBS配制）梯度溶液中直至标本下沉。

取大、小脑冰冻切片机作连续冠状切片，片厚30μm，0.01 mol/L PBS 6孔反应板接片　　1.4 免疫组织化学法（ABC法）　　取切片（隔5张取1张）冲洗，所有切片冲洗均用0.01mol/L 磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)冲洗5min，3次；室温下3%H2O2浸泡30 min，以灭活内源性过氧化物酶，冲洗；0.3%Tritonx-100浸泡30min，冲洗；5%羊血清室温下封闭1h；1∶500 Fos兔抗鼠多克隆抗体4℃冰箱反应72h，每天取出在室温下摇床中摇动20min，冲洗；1∶200生物素化羊抗兔室温孵育2.5h，冲洗；滴加1∶200 ABC复合物（提前半小时配制），室温孵育2h，冲洗；滴加0.05%二氨基联苯胺和0.03%H2O2显色5 min；0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)终止反应，贴片，常规脱水，透明，中性树胶封片对照实验采用0.01mol/L 磷酸盐缓冲液代替一抗，其余步骤相同　　1.5 显微照相及图像分析　　每只动物各取8张染色切片，每个部位取2张切片，在相同条件下，用Motic公司生产的images advanced 3.2图像采集系统采集图像并进行分析，测定观察部位的相对灰度平均值。

灰度即图像的深浅程度，系统数字化图像的范围为0－255阳性反应产物越深，灰度值越小，而相对灰度越大）各组之间取同侧相同部位的相对灰度平均值进行比较用SPSS13.0统计软件对各组相对灰度值平均值进行单因素方差分析　　2 结果 　　2.1 MTBE对脑组织Fos蛋白表达的影响　　Fos蛋白是c-fos基因的表达产物，它存在于神经元的胞核内神经元Fos蛋白阳性表达时其胞核呈棕黄色，胞浆不着色，Fos蛋白其表达程度越强染色越深MTBE1050mg/（kg·bw）染毒后实验结果表明：正常对照组大鼠脑内仅有少量的Fos蛋白阳性神经元，而在MTBE染毒组大脑皮质、丘脑、下丘脑和小脑皮质均有明显的Fos蛋白阳性神经元分布（见图1～4） 　　2.2 不同剂量MTBE对脑组织不同部位Fos蛋白表达的影响　　SD大鼠经MTBE不同浓度染毒1h后，脑组织中大脑皮质、丘脑、下丘脑、小脑皮质其神经元Fos蛋白表达明显增多，不同剂量MTBE染毒组Fos蛋白相对灰度值表现为随MTBE染毒剂量的增大，Fos蛋白的表达增强，且呈明显剂量－效应关系MTBE染毒组大脑皮质、丘脑、下丘脑、小脑皮质与对照组比较，其Fos蛋白表达的相对灰度平均值差异均有显著性（P<0.01或0.05），见表1。

随MTBE染毒剂量的增加，大脑皮质和小脑皮质其Fos蛋白表达的相对灰度平均值增大，较丘脑和下丘脑更为明显表1 MTBE对脑组织不同部位Fos蛋白表达的影响(略) 注：与对照组比较，a：P<0.05，b：P<0.01　　2.3 MTBE染毒后不同时间对不同部位Fos蛋白表达的影响　　SD大鼠经MTBE 1050mg/kg·bw染毒后在不同时间大脑皮质、丘脑、下丘脑、小脑皮质其Fos蛋白相对灰度平均值表现为：染毒的早期0.5h Fos蛋白的表达即刻增强，Fos阳性神经元明显增多，胞核着色加深，相对灰度平均值增高；在染毒后1.0h达到高峰，Fos阳性神经元表达最多，胞核着色最深，相对灰度平均值最大；随后在染毒后2.0h 时Fos阳性神经元减少，胞核着色变浅，相对灰度平均值变小，至染毒后8.0h Fos蛋白的表达降至正常水平MTBE染毒后0.5h至4.0h与对照组比较，Fos蛋白含量相对灰度平均值差异有显著性（P<0.01或0.05），染毒后8.0h与对照组比较，Fos蛋白含量相对灰度平均值差异无显著性（P>0.05），见表2Fos蛋白表达的相对灰度平均值其改变幅度大脑皮质和小脑皮质较丘脑和下丘脑更为明显。

　　3 讨论 MTBE作为一种无铅汽油添加剂，以往研究表明MTBE具有多系统毒性，个别 文献 提到MTBE对中枢神经系统具有毒作用，其神经毒性表现为明显的中枢抑制，人群调查研究表明接触低浓度MTBE可出现头。