药典高效液相色谱法、质谱法.doc

药典---高效液相色谱法、质谱法05１２ 高效液相色谱法 　 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱,对供试品进行分离测定的色谱措施注入的供试品,由流动相带入色谱柱内,各组分在柱内被分离,并进入检测器检测,由积分仪或数据解决系统记录和解决色谱信号 　 １.对仪器的一般规定和色谱条件 　 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据解决系统构成色谱柱内径一般为3.９～4.6mm,填充剂粒径为3～lOμｍ超高效液相色谱仪是适应小粒径(约2μm)填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高敏捷度检测的高效液相色谱仪 　　（１）色谱柱　 反相色谱柱:以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱常用的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等　 　正相色谱柱:用硅胶填充剂,或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱 　　离子互换色谱柱:用离子互换填充剂填充而成的色谱柱有阳离子互换色谱柱和阴离子互换色谱柱。

手性分离色谱柱:用手性填充剂填充而成的色谱柱　　 色谱柱的内径与长度,填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量,填充的致密与均匀限度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱 　 温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响为改善分离效果可合适提高色谱柱的温度,但一般不适宜超过60℃ 　残存硅羟基未封闭的硅胶色谱柱,流动相pH值一般应在2～8之间残存硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pＨ值的流动相,适合于pH　值不不小于2或不小于８的流动相 　 （2)检测器 最常用的检测器为紫外－可见分光检测器，涉及二极管阵列检测器,其她常用的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等 紫外－可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关,还与其构造有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用检测器,对所有物质均有响应,构造相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。

　 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定范畴内呈线性关系,但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量一般呈指数关系,一般需经对数转换 不同的检测器,对流动相的规定不同紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外-可见分光光度法(通则0401) 项下对溶剂的规定;采用低波长检测时,还应考虑有机溶剂的截止使用波长,并选用色谱级有机溶剂蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相 　 （3)流动相　反相色谱系统的流动相常用甲醇－水系统和乙腈-水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈－水系统流动相中应尽量不用缓冲盐，如需用时，应尽量使用低浓度缓冲盐用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时,流动相中有机溶剂一般不低于5％,否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定 　正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂,如二氯甲烷和正己烷等　 　 品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得变化外，其他如色谱柱内径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器敏捷度等,均可合适变化,以达到系统合用性实验的规定。

调节流动相组分比例时,当小比例组分的比例例X不不小于等于３3%时，容许变化范畴为0.７X～１.3X；当X不小于３3%时,容许变化范畴为X-10%～X+1０% 若需使用小粒径(约２μm)填充剂，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配;如有必要，色谱条件也应作合适的调节当对其测定成果产生争议时，应以品种项下规定的色谱条件的测定成果为准 当必须使用特定牌号的色谱柱方能满足分离规定期，可在该品种正文项下注明 　 2.系统合用性实验 　 色谱系统的合用性实验一般涉及理论板数、分离度、敏捷度、拖尾因子和反复性等五个参数 　按各品种正文项下规定对色谱系统进行合用性实验，即用规定的对照品溶液或系统合用性实验溶液在规定的色谱系统进行实验，必要时,可对色谱系统进行合适调节，以符合规定　 　(1)色谱柱的理论板数（n） 用于评价色谱柱的分离效能由于不同物质在同一色谱柱上的色谱行为不同,采用理论板数作为衡量色谱柱效能的指标时,应指明测定物质，一般为待测物质或内标物质的理论板数　 在规定的色谱条件下,注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图,量出供试品主成分色谱峰或内标物质色谱峰的保存时间tR和峰宽(W)或半高峰宽 (Ｗh/２）,按n＝１6（tR/W）2或　n=5.５4（ｔR/Wｈ/2)2计算色谱柱的理论板数。

tR、W、Wh／２可用时间或长度计（下同),但应取相似单位 　 　(２）分离度（Ｒ) 用于评价待测物质与被分离物质之间的分离限度,是衡量色谱系统分离效能的核心指标可以通过测定待测物质与已知杂质的分离度,也可以通过测定待测物质与某一指标性成分（内标物质或其她难分离物质）的分离度,或将供试品或对照品用合适的措施降解,通过测定待测物质与某一降解产物的分离度，对色谱系统分离效能进行评价与调节　　 无论是定性鉴别还是定量测定,均规定待测物质色谱峰与内标物质色谱峰或特定的杂质对照色谱峰及其她色谱峰之间有较好的分离度除另有规定外，待测物质色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度应不小于1.5分离度的计算公式为: 　 式中为相邻两色谱峰中后一峰的保存时间； 　 为相邻两色谱峰中前一峰的保存时间； 　 Wt１、W２及W1，h/２、Ｗ2，h/２分别为此相邻两色谱峰的峰 宽及半高峰宽（如图) 　 　当对测定成果有异议时，色谱柱的理论板数(n）和分离度（R）均以峰宽（W）的计算成果为准 　 （3)敏捷度 用于评价色谱系统检测微量物质的能力,一般以信噪比(S/Ｎ）来表达通过测定一系列不同浓度的供试品或对照品溶液来测定信噪比。

定量测定期,信噪比应不不不小于10;定性测定期，信噪比应不不不小于3系统合用性实验中可以设立敏捷度实验溶液来评价色谱系统的检测能力 （4）拖尾因子（T) 用于评价色谱峰的对称性拖尾因子计算公式为:　 　 　 式中 W0.05h为５%峰高处的峰宽； 　 　 d1为峰顶在5%峰高处横坐标平行线的投影点至峰前沿与此平行线交点的距离(如图) 　 以峰高作定量参数时，除另有规定外，T值应在0．95~1.０5之间 　 　以峰面积作定量参数时,一般的峰拖尾或前伸不会影响峰面积积分，但严重拖尾会影响基线和色谱峰起止的判断和峰面积积分的精确性，此时应在品种正文项下对拖尾因子作出规定 (5）反复性 用于评价色谱系统持续进样时响应值的反复性能采用外标法时,一般取各品种项下的对照品溶液，　持续进样5次，除另有规定外,其峰面积测量值的相对原则偏差应不不小于２.0％;采用内标法时,一般配制相称于80%、１０0%和120％的对照品溶液,加入规定量的内标溶液，配成３种不同浓度的溶液,分别至少进样2次，计算平均校正因子，其相对原则偏差应不不小于2．0% 　 3.测定法 （1）内标法 按品种正文项下的规定，精密称(量）取对照品和内标物质，分别配成溶液,各精密量取适量,混合配成校正因子测定用的对照溶液。

取一定量进样,记录色谱图测量对照品和内标物质的峰面积或峰高,按下式计算校正因子: 　　式中 Ａs为内标物质的峰面积或峰高;　 AR为对照品的峰面积或峰高； Cs为内标物质的浓度; 　 CR为对照品的浓度 　 再取各品种项下具有内标物质的供试品溶液，进样,记录色谱图,测量供试品中待测成分和内标物质的峰面积或峰高,按下式计算含量: 　 式中 Ax为供试品的峰面积或峰高; 　 cx为供试品的浓度； A'ｓ为内标物质的峰面积或峰高;　　 c＇ｓ为内标物质的浓度； 　　f为内标法校正因子 采用内标法，可避免因供试品前解决及进样体积误差对测定成果的影响　　 (2)外标法 按各品种项下的规定,精密称(量)取对照品和供试品，配制成溶液,分别精密取一定量，进样,记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测物质的峰面积(或峰高），按下式计算含量： 式中各符号意义同上　 由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定期,以手动进样器定量环或自动进样器进样为宜 (3）加校正因子的主成分自身对照法 测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。

在建立措施时,按各品种项下的规定，精密称(量)取待测物对照品和参比物质 对照品各适量，配制待测物校正因子的溶液,进样，记录色谱图,按下式计算待测物的校正因子 式中 cA为待测物的浓度;　 AA为待测物的峰面积或峰高; cB为参比物质的浓度; 　 AＢ为参比物质的峰面积或峰高ﻩ 　 也可精密称（量)取主成分对照品和杂质对照品各适量，分别配制成不同浓度的溶液,进样，记录色谱图,绘制主成分浓度和杂质浓度对其峰面积的回归曲线，以主成分回归直线斜率与杂质回归直线斜率的比计算校正因子 校正因子可直接载入各品种项下,用于校正杂质的实测峰面积需作校正计算的杂质,一般以主成分为参比,采用相对保存时间定位,其数值一并载入各品种项下　 测定杂质含量时,按各品种项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相称的溶液,作为对照溶液；进样,记录色谱图,必要时,调节纵坐标范畴（以噪声水平可接受为限）使对照溶液的主成分色谱峰的峰高约达满量程的10%～25％除另有规定外,一般含量低于0．5%的杂质, 峰面积的相对原则偏差(RSD)应不不小于10%;含量在0.5%~ 2%的杂质,峰面积的ＲSD应不不小于5%;含量不小于2%的杂质，峰面积的RSD应不不小于2%。

然后,取供试品溶液和对照溶液适量,分别进样，除另有规定外，供试品溶液的记录时间,应为主成分色谱峰保存时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积,分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，计算各杂质含量 (４)不加校正因子的主成分自身对照法 测定杂质含量时，若无法获得待测杂质的校正因子,或校正因子可以忽视，也可采用不加校正因子的主成分自身对照法同上述(3）法配制对照溶液、进样调节纵坐标范畴和计算峰面积的相对原则偏差后，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样除另有规定外,供试品溶液的记录时间应为主成分色谱峰保存时间的2倍,测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较，依法计算杂质含量 （5)面积归一化法 按各品种项下的规定，配制供试品溶液,取一定量进样,记录色谱图测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积,计算各峰面积占总峰面积的百分率用于杂质检查时，由于仪器响应的线性限制,峰面积归一化法一般不适宜用于微量杂质的检查0431　质谱法　　 质谱法是使待测化合物产气愤态离子，再按质荷比（m／z)将离子分离、检测的分析措施，检测限可达10-１5～l0-12mol数量级。

质谱法可提供分子质量和构造的信息，定量测定可采用内标法或外标。