注射用甲磺酸左氧氟沙星无菌检查方法学验证.pdf

注射用甲磺酸左氧氟沙星 (0.2g) 无菌检查方法学验证方案1. 概述： 公司根据市场发展需要拟计划规模化生产冻干粉针剂注射用甲磺酸左氧氟沙星 (0.2g)产品，生产车间的洁净度等级与无菌操作、无菌保障等剂型产品的工艺验证、阶段性的无菌灌装试验过程验证等已经完成根据中国药典 2005 版要求，我司生产的注射用甲磺酸左氧氟沙星(0.2g) 产品需做无菌等控制的检查， 需对无菌检查方法学进行验证， 以确保检验方法的准确可靠2. 项目名称： 注射用甲磺酸左氧氟沙星 (0.2g)无菌检查方法学验证3. 验证编号： VAL-JY-032(00)4. 验证形式： 同步验证5. 验证目的： 根据中国药典 2005 版要求，我司生产的注射用甲磺酸左氧氟沙星 (0.2g)产品需做无菌等控制的检查，需对检验方法学进行验证，以确保检验方法的准确可靠6. 验证参加人员： 根据验证项目，我们设立质控部注射用甲磺酸左氧氟沙星 (0.2g)无菌检查方法学验证小组，明确各自责任与分工，具体如下表：质控部注射用甲磺酸左氧氟沙星 (0.2g)无菌检查方法学验证小组各自责任与分工姓 名 部 门 小组职务 责任与分工负责组织验证方案的起草，验证报告的编制，并组织实施负责验证方案和验证报告的审核负责验证方案和验证报告的审核负责验证方案和验证报告的审核负责验证方案和验证报告的校核负责在设备维修与校验方面提供支持和服务负责按相关标准检验其符合性实施验证负责按相关标准对生产过程与取样的监控管理7．文件依据：7.1 ．检验通用标准操作规程。

7.2 ．生测室用工器具清洁灭菌标准操作规程7.3 ． 《中国药典》 2005 年版二部附录、通用检验操作规程和记录7.5 ． 《药品生产质量管理规范实施指南》 （ 2001 版） 7.6 ． 《药品生产验证指南》 （ 2003 版） 7.7 ．其它有关文件和记录8． 验证条件：8.1 ．空气净化等级：生测室空气净化等级一万级，超净台空气净化等级一百级8.2 检查用工器具已按清洁规程洗涤、干燥和灭菌8.3 检验用菌种的培养复壮工作已完成；8.4 计量检定、检验方法验证已完成；8.5 检验人员具有法定资质，持证上岗且具有较长工作经验8.6 检验方法验证及检验操作已有一定经验9．验证范围： 注射用甲磺酸左氧氟沙星 (0.2g) 冻干粉针剂无菌检验方法验证10．验证内容10.1 概述 注射用甲磺酸左氧氟沙星 (0.2g) 为冻干制剂，根据该剂型的要求无论产品配制、灌装、干燥过程均采用无菌操作的办法，所以生产过程的人、机、料、法、环境等均需在无菌保证的基础上进行避菌操作生产的产品除一般药典规定的性状、检查、鉴别、有关物质、含量测定等外，还须对产品的微生物控制项目— - 无菌检查进行控制作为投入生产的产品，为保证无菌检查项目的检验可靠性，须对无菌检验方法学进行验证。

10.2 无菌检查方法学验证：10.2.1 实验材料：10.2.1.1 样品名称：注射用甲磺酸左氧氟沙星 (0.2g) 冻干粉针，规格 0.2g/ 瓶生产厂家：福建省闽东力捷迅药业有限公司批号： 090201、 090202、 090203 数量： 100 瓶 / 批10.2.1.2 试验用菌株：金黄色葡萄球菌 CMCC(B) 26003 铜绿假单胞菌 CMCC(B) 10104 枯草芽孢杆菌 CMCC(B) 63501 生胞梭菌 CMCC(B) 64941 白色念珠菌 CMCC(F) 98001 黑曲霉 CMCC (F) 980003 10.2.1.3 培养基：硫乙醇酸盐流体培养基（批号： 090331 来源：中国药品生物制品检定所）改良马丁培养基（批号： 0810073 来源：中国药品生物制品检定所）营养琼脂培养基（批号： 080514 来源：中国药品生物制品检定所）营养肉汤培养基 （批号： 20081127 来源： 青岛高科园海博生物技术有限公司）玫瑰红钠琼脂培养基（批号： 060913 来源：中国药品生物制品检定所） 10.2.1.4 仪器与用具： HTY-2000 型智能集菌仪及一次性全封闭集菌器 （抗生素专用 KSF330， 三联） （杭州泰林医疗器械厂） 。

10.3 培养基的适用性检查培养基的检查包括无菌检查和灵敏度检查，符合规定者方可用于供试品的无菌检查和无菌检查方法验证培养基的无菌检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行，但是，一旦所用培养基不符合无菌要求，供试品的无菌检查结果应视为无效培养基的灵敏度检查应对购进的每个批号的脱水培养基进行灵敏度检查，检查合格后方可使用，但当培养基的配制方法与灭菌程序发生变更时，应再次对培养基的灵敏度进行检查10.3.1 培养基的无菌检查该项目与同样品检验同时进行将灭菌后培养基按样品规定的温度培养应无菌生长10.3.2 培养基灵敏度检查的操作及结果判定取每管装量为 12ml 的硫乙醇酸盐流体培养基 9 支，分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各 2 支，每支接种菌量为 1ml( 含菌小于 100cfu) ，另一支不接种作为空白对照，培养 3 天；取每管装量为 9ml 的改良马丁培养基 5 支，分别接种白色念珠菌、黑曲霉各 2 支，每支接种菌量为 1ml( 含菌小于 100cfu)，另 1 支不接种作为空白对照，培养 5 天逐日观察结果空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。

10.3.2.1 菌液制备：(1) 分别接种金黄色葡萄球菌、 铜绿假单胞菌、 枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，接种生胞梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中， 经 30～ 35℃培养 18～ 24 小时后， 上述培养物分别用 0.9%的无菌氯化钠溶液， 制成每 1ml 含菌数小于 100cfu 的菌悬液， 做活菌计数备用2) 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中经 23～ 28℃培养 24～ 48 小时，取白色念珠菌培养物用 0.9%的无菌氯化钠溶液制备成每 1ml 含菌株数小于 100cfu 的菌悬液， 做活菌计数备用3) 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，经 23～ 28℃培养 5～ 7 天，取黑曲霉斜面培养物，加入 3～ 5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，析出孢子悬液用 0.9%的无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含孢子数小于 100cfu 的孢子菌悬液，做活菌计数备用10.3.2.2 培养基灵敏度检查结果见下表表 1 培养基灵敏度试验结果试验菌种 验证加菌数(cfu) 硫乙醇酸盐流体培养基 (天 ) 改良马丁培养基 (天 ) 备注名 称 管 号 代 数 1 2 3 1 2 3 4 5 金 黄 色 葡 萄 球 菌(1) 2 25 + + + 试验菌均生长良好(2) + + + 铜绿假单胞菌(1) 2 56 + + + (2) + + + 枯草芽孢杆菌(1) 2 42 + + + (2) + + + 生孢梭菌(1) 2 71 + + + (2) - + + 白色念珠菌(1) 2 50 - + + + + (2) + + + + + 黑曲霉菌(1) 2 82 + + + + + (2) + + + + + 阴性对照改良马丁 - - - - - 硫乙醇酸盐 - - - 注： “ -”未长菌 “ +”长菌结果各菌种管均在规定的时间内生长，并生长良好，培养基灵敏度符合规定。

10.3.2.3 培养基灵敏度检验记录培养基灵敏度检验记录硫乙醇酸盐流体培养基 批号： 来源：改良马丁培养基 批号： 来源：培养基灭菌条件 灭菌温度： 灭菌时间：检验日期 报告日期试验结果试验菌种硫乙醇酸盐流体培养基 (天 ) 改良马丁培养基 (天 ) 备注名 称 管 号 代 数 1 2 3 1 2 3 4 5 金 黄 色 葡 萄 球 菌(1) 2 (2) 铜绿假单胞菌(1) 2 (2) 枯草芽孢杆菌(1) 2 (2) 生孢梭菌(1) 2 (2) 白色念珠菌(1) 2 (2) 黑曲霉菌(1) 2 (2) 阴性对照改良马丁硫乙醇酸盐菌液计数菌种名称金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌生胞梭菌白色念珠菌黑曲霉菌计数平均10.3.3 评价与小结：评价人： 复核人： 日期： 年 月 日10.4 无菌检查方法学验证方法：10.4.1 菌液制备：10.4.1.1 分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中， 接种生胞梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中， 经 30～ 35℃培养 18～ 24 小时后， 上述培养物分别用 0.9%的无菌氯化钠溶液， 制成每 1ml 含菌数小于 100cfu 的菌悬液， 做活菌计数备用。

10.4.1.2 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中经 23～ 28℃培养 24～ 48 小时，取白色念珠菌培养物用 0.9%的无菌氯化钠溶液制备成每 1ml 含菌株数小于 100cfu 的菌悬液， 做活菌计数备用10.4.1.3 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，经 23～ 28℃培养 5～ 7 天，取黑曲霉斜面培养物，加入 3～ 5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，析出孢子悬液用 0.9%的无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含孢子数小于 100cfu 的孢子菌悬液，做活菌计数备用10.4.2 样品试液的制备： 样品用 250ml 的 0.1%蛋白胨溶液溶解制成 250ml/30 瓶的供试液备用10.4.3 实验组：在无菌室中，取一次性全封闭集菌器（三联）一套，将本品 30 瓶用 250ml 的0.1%蛋白胨溶液溶解，按薄膜过滤法均匀滤至三管中，用 1500ml 的 0.1%蛋白胨溶液均匀冲洗三张滤膜，分 5 次冲洗，每桶每次 100ml，冲洗后夹住其中一管，在另两管中分别泵入改良马丁培养基 (100ml)后，夹紧两管口，松开另一筒，泵入硫乙醇酸盐培养基（ 100ml ）后，夹紧管口；另取一套一次性全封闭集菌器（三联） ，另取本品 30 瓶用 250ml 的 0.1%蛋白胨溶液溶解，按薄膜过滤法均匀滤至三管中，用 1500ml 的 0.1%蛋白胨溶液均匀冲洗三张滤膜，分 5 次冲洗，每桶每次 100ml，再向三管中分别泵入硫乙醇酸盐培养基（ 100ml ）并夹紧管口。

将上述两套一次性全封闭集菌器移至阳性检查室，于前两管中分别接入小于 100cfu 的白色念珠菌、黑曲霉，后四管中分别接入小于 100cfu 的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌、生孢梭菌，作为试验组硫乙醇酸盐流体培养基集菌器置 30~35℃培养 3-5 天，改良马丁培养基集菌器置 23~28℃培养 3-5 天，逐日观察10.4.4 阳性对照组：在无菌检查室中，取一次性全封闭集菌器（三联）两套，操作同前，向两管中分别泵入改良马丁培养基（ 100ml） ，并夹紧管口，向后四管中分别泵入硫乙醇酸盐培养基（ 100ml） 将上述两套一次性全封闭集菌器移至阳性检查室，于前两管中分别接入小于 100cfu 的白色念珠菌、黑曲霉，后四管中分别接入小于 100cfu 的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌、生孢梭菌，作为阳性对照组硫乙醇酸盐流体培养基集菌器置 30~35℃培养 3-5 天，改良马丁培养基集菌器置 23~28℃培养 3-5 天，逐日观察10.4.5 阴性对照组：在无菌室中，取一次性全封闭集菌器（三联）向两个管中分别泵入硫乙醇酸盐培养基、改良马丁培养基（ 100ml）夹紧，作为阴性对照组。

10.5 无 +B 菌检查方法学验证结果：试验组、阳性对照组、阴性对照组的观察情况（见表 2）表 2 方法验证试验结果试验菌种 验证加菌数(cfu) 硫乙醇酸盐流体培养基 (天 ) 改良马丁培养基 (天 ) 备注名 称 管 号 代 数 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 金 黄 。