实验三DNA限制性内切酶消化酶切.ppt

实验三实验三 DNA限制性内切酶 消化酶切实验原理l限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链位点上，并切割双链DNA限制性内切限制性内切酶酶酶分子酶分子识别位点识别位点切割位点切割位点 限制作用是限制作用是否需用否需用 ATPⅠ类类 三三亚亚基基双双功功能酶能酶 二分非对称二分非对称至至少少在在识识别别位位 点点 外外 1000bpYesⅡ类类内内切切酶酶与与甲甲基基化化酶酶分分子子不在一起不在一起4-6bp, 大大多多数数为为回回文文对对称结构称结构 在在识识别别位位点点中中或或靠靠近近识识别别位位点点无无特特异性异性NoⅢ类类二二亚亚基基双双功功能酶能酶 5-7 bp 非非对对称称在在识识别别位位点点下下 游游 24-26bpYes限制性内切酶可分为三类限制性内切酶可分为三类Ⅱ类限制性内切酶 Ⅱ类类酶酶切切割割位位点点在在识识别别序序列列中中，，有有的的在在对对称称轴轴处处切切割割, 产产生生平平末末端端的的DNA片片段段(如如SmaⅠ: 5‘-CCC↓GGG-3’)；；有有的的切切割割位位点点在在对对称称轴轴一一侧侧，，产产生生带带有有单单链链突突出出末末端端的的DNA片片段段称称粘粘性性末末端端，，如如EcoRⅠ切切割割识识别别序序列列后后产产生生两两个互补的粘性末端。

个互补的粘性末端 5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3' 3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5' 实验材料和试剂实验材料：实验材料： 玉米基因组玉米基因组DNA实验试剂：实验试剂：•BamH I 酶及其酶切缓冲液：购买成品酶及其酶切缓冲液：购买成品 •SalI酶及其酶切缓冲液：购买成品酶及其酶切缓冲液：购买成品•琼脂糖琼脂糖(Agarose)：进口或国产的电泳用琼脂：进口或国产的电泳用琼脂糖均可 实验仪器恒温水浴锅恒温水浴锅用手指轻弹管壁使溶液用手指轻弹管壁使溶液混匀，使混匀，使溶液集中在管底溶液集中在管底混匀反应体混匀反应体系后，系后，37℃水浴保水浴保温温2-3h 电泳检测电泳检测EP管编号管编号实验步骤实验步骤反应体系反应体系 20μL酶液酶液 DNA 15μL BamHⅠⅠ 1μL SalⅠⅠ 1μL 10×BufferT 3μL对质粒DNA酶切反应 限限制制性性内内切切酶酶用用量量可可按按标标准准体体系系1μg DNA加加1单单位位酶酶, 消消化化1-2h。

但但要要完完全全酶酶解解则则必必须须增增加加酶酶的的用用量量，，一一般般增增加加2-3倍倍，，甚甚至至更多，反更多，反应时间也要适当延长应时间也要适当延长 电泳检测示例实验注意事项1.限限制制性性内内切切酶酶用用量量可可按按标标准准体体系系1μg DNA加加1单单位位酶酶，，消消化化1-2h但但要要完完全全酶酶解解则则必必须须增增加加酶酶的的用用量量，，一一般般增增加加2-3倍倍，，甚甚至至更更多多，，反应时间也要适当延长反应时间也要适当延长 2.酶酶切切时时所所加加的的DNA溶溶液液体体积积不不能能太太大大，，否否则则DNA溶溶液液中中其其他他成成分分会干扰酶反应会干扰酶反应 3.许许多多实实验验制制备备的的DNA不不易易于于降降解解，，需需适适当当增增加加酶酶的的使使用用量量反反应应液液中中加加入入过过量量的的酶酶是是不不合合适适的的，，除除考考虑虑成成本本外外，，酶酶液液中中的的微微量量杂杂质质可可能干扰随后的反应能干扰随后的反应 4.市市场场销销售售的的酶酶一一般般浓浓度度很很大大，，为为节节约约起起见见，，使使用用时时可可事事先先用用酶酶反反应应缓缓冲冲液液（（1×））进进行行稀稀释释。

另另外外，，酶酶通通常常保保存存在在50%的的甘甘油油中中，，实实验验中，应将反应液中甘油浓度控制在中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否之下，否则酶则酶活性将受影响活性将受影响 思考题 如如果果一一个个DNA酶酶解解液液在在电电泳泳后后发发现现DNA未未被被酶酶切切或或者者酶酶切切不不完完全全, 你你认认为为可可能能是是什什么么原原因？因？ 。