第二章组培基本条件.ppt

第二章第二章   植物组织培养所需基本条件植物组织培养所需基本条件第一节第一节  培养基及其配制培养基及其配制第二节第二节   实验室的设置实验室的设置第三节第三节  常用仪器设备和器具常用仪器设备和器具 第四节第四节  环境条件环境条件第五节第五节  组培方案的筛选组培方案的筛选                    第一节第一节  培养基及其配制培养基及其配制一、培养基的成分一、培养基的成分l无机盐（大量元素、微量元素）无机盐（大量元素、微量元素）l有机营养成分有机营养成分（糖、维生素、氨基酸）（糖、维生素、氨基酸）l植物生长调节剂植物生长调节剂l天然有机添加物质天然有机添加物质l琼脂琼脂l活性炭活性炭根据植物对元素的吸收量，分为：根据植物对元素的吸收量，分为：1 1、大量元素、大量元素（大于（大于0.5mmol/L0.5mmol/L）：）：C、、H、、O、、N、、P、、K、、Ca、、Mg、、S；其中；其中C C、、H H、、O O为气体为气体元素，其余元素，其余6 6种为矿质元素种为矿质元素2 2、微量元素、微量元素（小于（小于0.5mmol/L0.5mmol/L）：）：Fe、、B、、Mn、、Zn、、Mo、、Cu、、Co、、Cl（一）、无机盐（一）、无机盐（一）无机盐（一）无机盐1.大量元素大量元素（（MS培养基为例培养基为例）序号序号化学式化学式用量用量（（mg/L））1KNO319002NH4NO316503KH2PO41704MgSO4.7H2O3705CaCL2.4H2O440（一）无机盐（一）无机盐2.微量元素微量元素（（MS培养基）培养基）序序号号化学式化学式用量用量（（mg/L)1KI0.832H3BO36.23MnSO4.4H2O22.34ZnSO4.7H2O8.65Na2MoO4.2H2O0.256CuSO4.5H2O0.0257CoCl2.6H2O0.025（二）有机营养成分（二）有机营养成分1、糖类、糖类l种类：种类：蔗糖、葡萄糖、果糖。

其中蔗糖、葡萄糖、果糖其中以蔗糖最常用以蔗糖最常用l作用：作用：提供碳源、能量、保持培养提供碳源、能量、保持培养基的渗透压基的渗透压l用量：用量：1%～～5% （二）有机营养成分（二）有机营养成分 2、维生素类、维生素类  常用的有常用的有Vc 、、B1 、、B6 、、B12、、烟酸、生物素等烟酸、生物素等  （二）有机营养成分（二）有机营养成分3、氨基酸、氨基酸l常用的有：甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸等常用的有：甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸等l水解酪蛋白水解酪蛋白(CH)和水解乳蛋白（和水解乳蛋白（LH））是是多种氨基酸的混合物，在培养基中也时多种氨基酸的混合物，在培养基中也时常添加（三）植物生长调节物质（三）植物生长调节物质 用量很小，但对外植体的生长和用量很小，但对外植体的生长和分化起着决定作用影响最显著分化起着决定作用影响最显著的是生长素类和细胞分裂素类的是生长素类和细胞分裂素类  1．生长素类生长素类l种类：种类：    2,4-D ：：2,4-二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸    NAA：：萘乙酸萘乙酸    IAA：：引哚乙酸引哚乙酸    IBA：：引哚丁酸引哚丁酸l作用：作用：诱导愈伤组织、胚状体的产生，试诱导愈伤组织、胚状体的产生，试管苗生根。

管苗生根2. 细胞分裂素类细胞分裂素类•种类种类 KT：：激动素（激动素（6-糠基氨基嘌呤糠基氨基嘌呤）） 6-BA：：6-苄基氨基嘌呤苄基氨基嘌呤 ZT：：玉米素玉米素 2-iP：：2-异戊烯腺嘌呤异戊烯腺嘌呤2. 细胞分裂素类细胞分裂素类•作用作用  促进细胞分裂，由愈伤组织或器促进细胞分裂，由愈伤组织或器官上分化出不定芽，促进芽的增官上分化出不定芽，促进芽的增殖3、根和芽形成的激素控制特点根和芽形成的激素控制特点 生长素与细胞分裂素的比值和绝对含生长素与细胞分裂素的比值和绝对含量，控制着植物组织的形态发生量，控制着植物组织的形态发生                                                                                 生长素生长素/细胞细胞分裂素比值分裂素比值高：高： 有利于根的形成有利于根的形成低：低： 有利于芽的形成有利于芽的形成适中适中：维持原组织生长而不分化：维持原组织生长而不分化（四）天然有机添加物（四）天然有机添加物•常用种类和浓度为：常用种类和浓度为：•椰子乳椰子乳10% 10% 酵母提取物酵母提取物0.5%0.5%•番茄汁番茄汁5%5%～～10% 10% 香蕉泥香蕉泥100100～～200 mg/L200 mg/L•作用是提供微量营养成分、生理活性物质和生长激素作用是提供微量营养成分、生理活性物质和生长激素等。

等  （五）琼脂（五）琼脂 从海藻中提取的一种高分子碳水化合物，从海藻中提取的一种高分子碳水化合物，作为凝固剂，不参与代谢作为凝固剂，不参与代谢用量：用量：0.6%～～1.0%  （六）活性炭（六）活性炭•来源：来源：用木炭粉碎加工形成用木炭粉碎加工形成•作用：作用：吸附作用，减轻有害物质对培养物吸附作用，减轻有害物质对培养物的毒害吸附没有选择性，在吸附有害物的毒害吸附没有选择性，在吸附有害物质的同时，也吸附有用物质质的同时，也吸附有用物质•使培养基变黑，有利于生根使培养基变黑，有利于生根 •用量：用量：0.1％－％－0.5%二、培养基的种类和选择二、培养基的种类和选择1、基本培养基和完全培养基基本培养基和完全培养基l 基本培养基：基本培养基：包括无机盐、维生素、氨包括无机盐、维生素、氨基酸、糖和水等基酸、糖和水等l 完全培养基：完全培养基：在基本培养基的基础上，在基本培养基的基础上，根据培养目的，添加其它一些物质如：根据培养目的，添加其它一些物质如：植物生长调节物质，天然有机物（椰乳、植物生长调节物质，天然有机物（椰乳、香蕉泥等）香蕉泥等）  MS培养基配方硝酸铵 1650 硫酸锌 8.6 硝酸钾 1900 氯化钴 0.025 氯化钙 440 硫酸铜 0.025 硫酸镁 370 钼酸钠 0.25 磷酸二氢钾 170 碘化钾 0.83 硫酸亚铁 27.8  肌醇   100 EDTA-Na2 37.3 烟酸 0.5 硼酸 6.2盐酸吡哆素 0.5 硫酸锰 22.3 盐酸硫胺素 0.1 甘氨酸 2 mg/L2、基本培养基的种类基本培养基的种类•种类：种类：众多，有几百种，但较常用的仅一众多，有几百种，但较常用的仅一二十种。

二十种•名称：名称：多数以发明人的姓名来命名，如多数以发明人的姓名来命名，如White培养基，培养基，Murashige和和Skoog培养基培养基(简称简称MS培养基培养基)3 3、培养基的类型、培养基的类型3.1 3.1 高盐浓度培养基：高盐浓度培养基：MSMS、、B5B5等 适用于多数营养需求量较大的植物适用于多数营养需求量较大的植物3.2 3.2 中等盐浓度培养基：中等盐浓度培养基：NitshNitsh、、MillerMiller等等 大量元素浓度约为大量元素浓度约为MSMS的的1/21/23.3 3.3 低盐培养基：低盐培养基：WPMWPM、、 WhiteWhite等 大量元素浓度约为大量元素浓度约为MSMS的的1/41/4 适用于木本植物的培养适用于木本植物的培养4、培养基的选择、培养基的选择   不同植物、培养部位和培养目的应不同植物、培养部位和培养目的应选择不同的培养基在建立一个新选择不同的培养基在建立一个新的实验体系时，一般的实验体系时，一般先由一种已被先由一种已被广泛采用的培养基开始（如广泛采用的培养基开始（如MS、、N6、、B5等）等） 。

 三、培养基的配制方法三、培养基的配制方法（一）、流程图（一）、流程图•  （二）母液配制（以（二）母液配制（以MS培养基为例）培养基为例）   氯化钙氯化钙铁盐铁盐大量元素大量元素 微量元素微量元素有机物质有机物质配制配制MS培养基时母液的计算培养基时母液的计算（二）、母液的配制（二）、母液的配制l扩大倍数：扩大倍数：10～～100倍l意义：意义：提高工作效率，减小称量误差提高工作效率，减小称量误差药品称量一次，就可以使用多次药品称量一次，就可以使用多次 1、、母液配制原则母液配制原则 相同类型的试剂混合；相同类型的试剂混合； 易沉淀的药品分开；易沉淀的药品分开； 母液浓度要适宜；母液浓度要适宜； 用量要认真计算和核对；用量要认真计算和核对； 药品要准确称量药品要准确称量 2、大量元素母液大量元素母液（扩大（扩大10倍）倍）成分成分规定量规定量(mg/L)称取量称取量(mg)母液体母液体积（积（ml)配配1升培升培养基用量养基用量（（ml)KNO3NH4NO3 MgSO4.7H2OKH2PO4 190016503701701900016500370017001000100CaCl2.2H2O44044001000100                                       母液体积母液体积配配1升培养基用量＝升培养基用量＝ 扩大倍数扩大倍数3．微量元素母液微量元素母液•铁盐容易形成铁盐容易形成Fe(OH)3沉淀沉淀•硫酸亚铁与硫酸亚铁与Na2-EDTA混合，混合，形成络合物。

形成络合物•其它微量元素分别充分溶解后混合定容为一其它微量元素分别充分溶解后混合定容为一瓶，扩大倍数为瓶，扩大倍数为100倍 3、微量元素母液微量元素母液（扩大（扩大100倍）倍）成分成分规定量规定量(mg/L)称取量称取量(mg)母液体母液体积（积（ml)配配1升培升培养基用养基用量（量（ml)MnSO4.4H20ZnSO4.7H2OH3BO3KINa2MoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCl2.6H2O22.308.606.200.830.250.0250.025223086062083252.52.51000104、铁盐母液、铁盐母液（扩大（扩大100倍）倍）成分成分规定量规定量(mg/L)称取量称取量(mg)母液体母液体积积（（ml)配配1升培升培养基用养基用量（量（ml)Na2-EDTA FeSO4.4H2O37.3027.80373027801000105、有机物母液、有机物母液（扩大（扩大50倍）倍）成分成分规定量规定量(mg/L)称取量称取量(mg)母液体母液体积积（（ml)配配1升培升培养基用养基用量（量（ml)甘氨酸甘氨酸维生素维生素b1维生素维生素b6烟酸烟酸肌醇肌醇2.000.100.500.50100100525255000500106．生长调节物质母液生长调节物质母液u不溶于水，先溶于助溶剂。

不溶于水，先溶于助溶剂uNAA、、IAA、、IBA、、2,4-D及及赤赤霉霉素素、、玉玉米米素等，先溶于少量素等，先溶于少量95%酒精，再加水定容；酒精，再加水定容；u KT和和BA等等，，先先溶溶于于少少量量的的1mol/L盐盐酸酸中中，，再加水定容再加水定容6．生长调节物质母液生长调节物质母液 母液浓度：母液浓度：用量小，使用的浓度单位用量小，使用的浓度单位是是mg/L，，因此母液一般配制成因此母液一般配制成0.1mg/ml，或，或1mg/ml；；7．琼脂、蔗糖琼脂、蔗糖 用用量量大大，，不不需需要要配配制制母母液液，，随随称称随随用用8、母液标签、母液标签•注明母液名称、配制注明母液名称、配制1升培养基升培养基时应取的数量时应取的数量大量元素100 ml/L9、母液保存、母液保存u一般在一般在2～～4℃℃的冰的冰箱中保存箱中保存u生霉或沉淀，就不生霉或沉淀，就不能再使用能再使用 (三三)培养基的配制（按培养基的配制（按1L计）计）   1、确定配方、确定配方MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.2mg/L+3%蔗糖蔗糖+0.8%琼脂琼脂2、配方用量计算、配方用量计算大量元素（大量元素（扩大扩大10倍配倍配1L））微量元素微量元素（扩大（扩大100倍配倍配1L））有机物有机物（扩大（扩大50倍配倍配500ml））铁盐铁盐（扩大（扩大100倍配倍配1L））6-BA(1 mg/ml)NAA(0.1mg/ml)蔗糖蔗糖琼脂琼脂100 ml10 ml10 ml10 ml1.5 ml2 ml30 g8 g  称称8g琼琼脂脂、、30g蔗蔗糖糖放放在在搪搪瓷瓷杯杯里里，，加入约加入约700ml蒸馏水，电炉上加热溶化。

蒸馏水，电炉上加热溶化3、、琼脂和蔗糖的溶化琼脂和蔗糖的溶化4．母液的量取和定容母液的量取和定容•用用移移液液管管（（不不能能混混用用））或或量量筒筒将将母母液液依依次次加加入入烧烧杯杯中中再再与与已已溶溶化化的的琼琼脂脂、、蔗糖混合、定容蔗糖混合、定容5．．pH值的调整值的调整A、、不同植物对酸碱度的要求不同，多数培养基不同植物对酸碱度的要求不同，多数培养基        的的pH值为值为5.6～～6.0 B、、常用常用1 mol/L的的NaOH和和HCl调整调整pH值C、、pH影响培养基的硬度影响培养基的硬度         pH ＜＜5.0   培养基不易凝固培养基不易凝固D、、灭菌后，培养基的灭菌后，培养基的pH会降低会降低 0.2－－0.3种种类pH值杜杜鹃4.0月季月季5.8桃桃7.0不同植物的最适不同植物的最适pH值值 酸和碱的配制酸和碱的配制•1 mol/L NaOH：：称称取取4g的的NaOH，，溶解后定容至溶解后定容至100ml•1  mol/L  HCl：： 量量 取取 8.4ml的的 浓浓HCl（（12 mol/L），定容至），定容至100ml6．培养基的分装培养基的分装•分分装装量量：：随随培培养养容容器器大大小小而而异异，，约约一指厚即可。

一指厚即可•注注意意：：不不要要把把培培养养基基粘粘到到瓶瓶口口上上，，以免染菌以免染菌•封口：封口：封好瓶口，准备灭菌封好瓶口，准备灭菌（四）培养基的灭菌和保存培养基的灭菌和保存1．消毒和灭菌的概念消毒和灭菌的概念1.1 消消毒毒：：指指采采用用物物理理或或化化学学方方法法杀杀死死物物体体表表面面的的微微生生物物（（不不包包括括细细菌菌的芽孢和真菌的孢子）的芽孢和真菌的孢子）1.2 灭灭菌菌：：指指采采用用物物理理或或化化学学方方法法杀杀死死物物体体表表面面及及其其内内部部的的一一切切微微生生物物（（包包括括细细菌菌的的芽芽孢孢和和真真菌菌的的孢子）孢子）2．高温高压湿热灭菌．高温高压湿热灭菌  2.1灭菌条件灭菌条件  压力压力0.105MPa，温度，温度121℃℃  2.2灭菌时间灭菌时间取决于待消毒液体容积的大小，取决于待消毒液体容积的大小，15-30min. 培养基灭菌最少时间培养基灭菌最少时间 液体容积（液体容积（ml）） 121℃℃下，时间（下，时间（min）） 20～～50 1575～～150 20250～～500 251000 30手提式高压锅灭菌步骤手提式高压锅灭菌步骤装锅装锅加水加水盖锅盖盖锅盖通电加热通电加热排冷空气排冷空气升温保压升温保压断电降压断电降压出锅冷却出锅冷却2.3灭菌操作灭菌操作u 将培养瓶放入灭菌锅，盖好锅盖。

将培养瓶放入灭菌锅，盖好锅盖u压压力力上上升升到到0.05 MPa时时（（111℃℃）），，打打开开“放气阀放气阀”将冷空气排尽，关闭将冷空气排尽，关闭“放气阀放气阀”u压压力力达达到到0.105 MPa时时（（121℃℃）），，维维持持足足够时间，关闭电源够时间，关闭电源u待压力回复到待压力回复到“0”时才可以开启灭菌锅时才可以开启灭菌锅2.4 排除冷空气的重要性排除冷空气的重要性 冷空气使锅内温度不一致，底层的温度冷空气使锅内温度不一致，底层的温度达不到达不到121℃℃，导致培养基不能充分灭，导致培养基不能充分灭菌 温度与排气的关系温度与排气的关系（（0.105Mpa）） 排气排气量量 完全完全排除排除 2/3 1/2 1/3 未排未排除除 温度温度/℃℃ 121 115 112 109 100 3．过滤除菌过滤除菌•在高温下易分解的试剂，如在高温下易分解的试剂，如GA3、、IAA、、椰子汁等，用过滤除菌椰子汁等，用过滤除菌•滤膜孔径为滤膜孔径为0.45μm 3．过滤除菌过滤除菌过过滤滤器器漏斗型：大量液体过滤漏斗型：大量液体过滤注射器型：小量液体过滤注射器型：小量液体过滤u为加速过滤，可在漏斗下安真空泵抽气。

为加速过滤，可在漏斗下安真空泵抽气u需在超净工作台上进行，所有器皿事先需需在超净工作台上进行，所有器皿事先需要灭菌A、、漏斗型过滤除菌装置漏斗型过滤除菌装置B、、注射器型过滤除菌装置注射器型过滤除菌装置 过滤灭菌过滤灭菌 滤膜滤膜Ø0.45umØ0.45um以下以下1.1.过滤器先灭菌，灭菌过滤器先灭菌，灭菌温度不超过温度不超过121℃121℃ 2.2.溶液先进行初滤溶液先进行初滤4．培养基的保存培养基的保存u一般等培养基冷却后即可使用一般等培养基冷却后即可使用u 为保险起见，也有在培养室中预培养为保险起见，也有在培养室中预培养2～～3d，，如果没有出现杂菌污染才使用如果没有出现杂菌污染才使用的第二节第二节   实验室的设置实验室的设置•选址：选址：选择采光良好、通风、清洁的选择采光良好、通风、清洁的地方作实验室地方作实验室•规模：规模：根据需要与可能性来安排，不根据需要与可能性来安排，不可一概而论可一概而论•可新建或旧房改造可新建或旧房改造一、实验室设计原则一、实验室设计原则1、方便方便  规规模模化化生生产产的的组组培培实实验验室室，，尽尽量量将将主主要要功功能能房房间间集集中中在在同同一一层层楼楼，，方方便便操作。

操作 2、、   无菌无菌u设设一一走走道道，，先先经经过过走走道道再再进进入入实实验验室室，，保持清洁，减少污染保持清洁，减少污染u接接种种室室外外设设一一缓缓冲冲间间，，以以便便更更换换衣衣帽帽等等缓缓冲冲间间及及接接种种室室内内均均需需安安装装紫紫外外灯，可随时消毒灯，可随时消毒3、节能、节能u培养室应设在房屋的南面，设大窗户，培养室应设在房屋的南面，设大窗户，尽量利用自然光照，减少照明费用，尽量利用自然光照，减少照明费用，降低成本降低成本u培养室房间不宜太大，门装成滑门，培养室房间不宜太大，门装成滑门，便于保温，节省能源便于保温，节省能源 培养室的大窗子4、安全安全u 接接种种室室处处于于密密闭闭状状态态，，容容易易造造成成室室内空气污浊，影响身体健康内空气污浊，影响身体健康u安安装装空空气气循循环环过过滤滤装装置置，，保保持持室室内内空空气新鲜洗洗涤涤 室室配配制制室室灭灭菌菌室室接接种种室室培培养养室室组培实验室组培实验室观观察察室室二、实验室设置二、实验室设置储储存存 室室实验室平面图一实验室平面图一配制室配制室灭菌室灭菌室观察室观察室 贮藏室贮藏室走　　　廊走　　　廊 洗涤室洗涤室培养室培养室接种室接种室培养室培养室实验室平面图二实验室平面图二三、实验室功能设置三、实验室功能设置（一）贮藏室（一）贮藏室   贮存暂时不用的器皿、用具、药品等，贮存暂时不用的器皿、用具、药品等，也可用作种质保存。

也可用作种质保存功能：功能：玻璃器具的玻璃器具的清洗、清洗、 干燥和贮存干燥和贮存 配备：配备：上下水上下水、水槽水槽（二）洗涤室（二）洗涤室蒸馏水器放在这间，利用冷却蒸馏水器放在这间，利用冷却水洗涤，既暖和又提高了水的水洗涤，既暖和又提高了水的利用率（三）配制室（三）配制室功能：功能：培养基配制培养基配制配备：配备：药品柜、天平、药品柜、天平、工作台、冰箱等工作台、冰箱等配制室的配制室的设置及配置及配备药品柜药品柜冰箱冰箱天平天平配制室的配制室的设置及配置及配备功能：功能：培养基灭菌培养基灭菌配备：配备：高压灭菌锅高压灭菌锅（四）灭菌室（四）灭菌室 灭菌室的菌室的设置及配置及配备（五）接种室（五）接种室功能：功能：材料消毒、接种、转移培养物材料消毒、接种、转移培养物结构：结构：接种室接种室 + + 缓冲间缓冲间(2m(2m2 2) ) 配备：配备：超净工作台超净工作台 面积：面积：1010－－2020m2 要求要求: :墙壁光滑、配置梭门，门窗严密墙壁光滑、配置梭门，门窗严密超净工作台超净工作台电子灭菌器电子灭菌器臭氧灭菌机臭氧灭菌机缓冲间接种室接种室接种操作接种操作（六）培养室（六）培养室配备：配备：培养架、培养架、照明、控温设备照明、控温设备面积：面积：根据规模定根据规模定 功能：功能：材料培养材料培养 培养室培养室1、温度控制温度控制•培养温度：培养温度：一般一般25±2℃℃。

•安装空调；安装空调；•在不需要降温的地区，可用在不需要降温的地区，可用“电炉电炉+温度指示控制仪温度指示控制仪”，，实现自动控温实现自动控温 温度指示控制仪＋电炉温度指示控制仪＋电炉2、辅助光照辅助光照u光光照照强强度度：：1000－－6000 Lux，，除除了了开开设设大大窗窗户户，，充充分分利利用用自自然然光光外外，，还还需需安装辅助光源安装辅助光源u日光灯安装在培养架上日光灯安装在培养架上2、辅助光照辅助光照u每层培养架安装每层培养架安装2支日光灯，光强支日光灯，光强2000～～3000 Luxu安装自动计时器（安装自动计时器（微电脑时控开关）微电脑时控开关）控制光控制光照时间，可实现自动控制照时间，可实现自动控制 微电脑时控仪微电脑时控仪（六）观察室（六）观察室功能：功能：观察观察培养材料的生长分化情况培养材料的生长分化情况 配备：配备：显微镜，切片机等显微镜，切片机等第三节第三节  常用仪器和用具常用仪器和用具 （（一）天平一）天平     1．药物天平（粗天平）．药物天平（粗天平）  称称量量精精度度为为0.1g，，称称取取蔗蔗糖糖、、琼琼脂脂以以及及用量较大药品。

用量较大药品2．分析天平分析天平 u精度为精度为0.1mg，称取微量元素和植物，称取微量元素和植物激素等u放置天平的地方，要平稳、干燥，避放置天平的地方，要平稳、干燥，避免腐蚀性药品和水气免腐蚀性药品和水气药物天平药物天平分析天平分析天平 （二）高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅u组培最基本的设备，用于培养基、器械等组培最基本的设备，用于培养基、器械等的灭菌u有大型卧式有大型卧式（（200 L））、、中型立式（中型立式（50L））、、小型手提式（小型手提式（18 L））等多种，可根据生产等多种，可根据生产规模和财力加以选用大型的效率高，小规模和财力加以选用大型的效率高，小型方便灵活型方便灵活 手提式灭菌锅手提式灭菌锅 各种型号的高压灭菌锅各种型号的高压灭菌锅大型卧式灭菌锅大型卧式灭菌锅（三）烘箱（三）烘箱   u玻璃器皿烘干：玻璃器皿烘干：温度温度80-100℃℃u干热灭菌：干热灭菌：温度温度150～～160℃℃，持续，持续1～～3小时 （四）冰箱（四）冰箱 用用于于试试剂剂和和母母液液的的保保存存家家用用冰冰箱箱即即可可，，宜选用冷藏室较大的型号宜选用冷藏室较大的型号。

冰冰箱箱 （五）酸度计（五）酸度计u笔式酸度计笔式酸度计较方便，在使用之前应先进较方便，在使用之前应先进行校正，使用之后将电极冲洗干净，并行校正，使用之后将电极冲洗干净，并将电极浸泡在蒸馏水中将电极浸泡在蒸馏水中u也可用精密也可用精密 pH试纸试纸（（pH值值5.4～～7））来代来代替测定pH值时，应搅拌均匀后再测值时，应搅拌均匀后再测 （六）蒸馏水器（六）蒸馏水器  组培常用蒸馏水或无离子水，蒸馏水可用组培常用蒸馏水或无离子水，蒸馏水可用金属蒸馏水器大批制备金属蒸馏水器大批制备 蒸馏水器规格蒸馏水器规格出水量出水量（（L/h）） 51020功率功率（千瓦）（千瓦） 4.57.515 （七）空调机（七）空调机 用于培养室恒温控制，根据培养用于培养室恒温控制，根据培养室大小，选装不同功率的室大小，选装不同功率的（八）超净工作台（八）超净工作台•用途：用途：接种、转苗的无菌工作台面接种、转苗的无菌工作台面•型号：型号：有单人、双人及三人式的，有开放有单人、双人及三人式的，有开放和密封式的，有垂直送风和水平送风的类和密封式的，有垂直送风和水平送风的类型 超净工作台超净工作台超净工作台超净工作台 （八）超净工作台（八）超净工作台•原理原理: 将空气过滤后流过工作台面。

将空气过滤后流过工作台面•维护：维护：放在空气干净，地面清洁的地方放在空气干净，地面清洁的地方使用过久，引起堵塞时，需要清洗和更使用过久，引起堵塞时，需要清洗和更换过滤网换过滤网 （九）解剖镜（九）解剖镜•用于培育脱毒苗时剥取茎尖，以及隔用于培育脱毒苗时剥取茎尖，以及隔瓶观察培养物的生长情况瓶观察培养物的生长情况体视显微镜体视显微镜倒置显微镜倒置显微镜显微镜显微镜倒置显微镜倒置显微镜 （十）培养架（十）培养架u架子用金属、木材制作，隔板用玻璃、金属架子用金属、木材制作，隔板用玻璃、金属筛网u一般设一般设5层，最低一层离地层，最低一层离地10 cm，其他层，其他层高高30cm，培养架高，培养架高1.7m左右，宽左右，宽60cmu每层台板上方安装日光灯作辅助光源每层台板上方安装日光灯作辅助光源 培养架培养架培养架培养架培养箱培养箱光照培养箱光照培养箱（十一）（十一） 驯化设备驯化设备温室温室大棚大棚二、必要的用具二、必要的用具（一）玻璃器皿玻璃器皿 1．计量器皿计量器皿     ①①量筒量筒     ②②容量瓶容量瓶      ③③吸管吸管 2．烧杯烧杯3．试剂瓶试剂瓶 计量器皿计量器皿对玻璃器皿要求：对玻璃器皿要求： 　　1.1.耐腐蚀；耐高温、耐腐蚀；耐高温、高压；高压； 　　2.2.透明度好；透明度好； 　　3.3.便于接种。

便于接种4．培养瓶培养瓶u早期用试管、三角瓶，不好操作早期用试管、三角瓶，不好操作u现在一般是用果酱瓶现在一般是用果酱瓶(250ml、、350ml)，瓶口，瓶口大，操作方便也有用其它培养容器的大，操作方便也有用其它培养容器的 5．酒精灯酒精灯•用于金属器具的用于金属器具的灭菌；及在火焰灭菌；及在火焰边无菌操作边无菌操作（二）金属器械（二）金属器械1．镊子镊子   16－－25 cm长的长的枪状镊子，枪状镊子，因其腰部因其腰部弯曲，使用方便弯曲，使用方便 镊子镊子灭菌器灭菌器推车推车2．剪刀剪刀12～～15 cm长的长的弯头剪弯头剪好用，特别适用于培养好用，特别适用于培养瓶内剪苗瓶内剪苗 （三）封口材料（三）封口材料u小瓶口：小瓶口：常用棉塞，外面再包一层牛皮纸；常用棉塞，外面再包一层牛皮纸；也可用铝箔包住也可用铝箔包住u大瓶口：大瓶口：常用塑料瓶盖、薄膜、双层硫酸常用塑料瓶盖、薄膜、双层硫酸纸  第四节第四节  环境条件环境条件一、温度一、温度1、培养温度、培养温度  多数为多数为25±2℃℃，并保持恒温培养，并保持恒温培养  不同植物的温度不同，如：百合不同植物的温度不同，如：百合20℃℃、月季、月季25-27℃℃、番茄、番茄28℃℃。

培养温度培养温度u 喜温植物培养温度较高，喜温植物培养温度较高，26-28℃℃  如茄科、葫芦科等如茄科、葫芦科等u 耐寒植物培养温度较低，耐寒植物培养温度较低，18-22℃℃    如百合科、十字花科、菊科等如百合科、十字花科、菊科等 2、低温预处理、低温预处理u在花药培养中，通过低温预处理，在花药培养中，通过低温预处理，可以促进细胞的脱分化和再分化可以促进细胞的脱分化和再分化u如：采用如：采用3℃℃预处理预处理48小时，可使曼小时，可使曼陀罗花粉的胚状体诱导率提高陀罗花粉的胚状体诱导率提高33.6% 二、光照二、光照1、光周期光周期1.1愈伤组织诱导：愈伤组织诱导：暗培养较好暗培养较好1.2器官发生：器官发生：需要周期性光照，光照时间需要周期性光照，光照时间12－－16 h2、光照强度、光照强度u范围范围1000-6000 lx,常用常用3000-4000 lxu采光好的培养室，自然光就可满足；采光好的培养室，自然光就可满足；    采光差的培养室，用日光灯为辅助光源采光差的培养室，用日光灯为辅助光源  三、通气状况三、通气状况u固体培养时，培养物不能埋入培养基固体培养时，培养物不能埋入培养基。

u液体培养时，则需进行振荡或浅层培养液体培养时，则需进行振荡或浅层培养以保证氧气供应以保证氧气供应第五节　组培方案的筛选第五节　组培方案的筛选一、组培方案筛选步骤一、组培方案筛选步骤文献检索文献检索预备试验预备试验参观咨询参观咨询最佳组培最佳组培 　方案筛选　　方案筛选　正规试验正规试验二、文献检索二、文献检索 ◆植物的学名、品种名、商品名植物的学名、品种名、商品名◆此种植物组培的相关报道此种植物组培的相关报道三、收集、分析的技术信息三、收集、分析的技术信息A、外植体类型与取材时间；、外植体类型与取材时间；B、诱导、继代、生根培养基配方；、诱导、继代、生根培养基配方；C、培养条件（温度、光照、、培养条件（温度、光照、pH值等）；值等）；D、移栽驯化条件及基质配比移栽驯化条件及基质配比四、预备试验四、预备试验 针对某些关键因素针对某些关键因素简单拟定试验方案，简单拟定试验方案，粗略判断其是否有粗略判断其是否有影响及影响程度、影响及影响程度、剂量的大致范围剂量的大致范围1、单因子试验、单因子试验 2、多因子试验、多因子试验 五、最佳组培方案的筛选五、最佳组培方案的筛选1、单因子试验、单因子试验 培养基的其它成分保持不变，培养基的其它成分保持不变，只改变一种只改变一种成分，成分，从而筛选出最佳培养基的方法。

从而筛选出最佳培养基的方法1、单因子试验、单因子试验编编  号号12345NAA（（mg/L））00.51.01.52.02、多因子试验、多因子试验•改变培养基中改变培养基中2种或种或2种以上成分种以上成分（通常是（通常是植物激素），得到最佳浓度配比的方法植物激素），得到最佳浓度配比的方法•根据复杂程度，可分为完全试验和正交试根据复杂程度，可分为完全试验和正交试验两种2 2因素因素3 3水平水平NAA（（mg/L) 6－－BA（（mg/L) 低　　　　　中　　　　　高低　　　　　中　　　　　高 低低中中高高低低低低 低中低中 低高低高中低中低 中中中中 中高中高高低高低 高中高中 高高高高2.1 完全试验完全试验 2 2因素因素5 5水平水平                   6－BA（mg/L)A1          A2          A3           A4          A5    NAA（（mg/L) B1B2  B4 B3B5B1A1      B1A2      B1A3      B1A4     B1A5B2A1      B2A2      B2A3      B2A4     B2A5B3A1      B3A2      B3A3      B3A4     B3A5B4A1      B4A2      B4A3      B4A4     B4A5B5A1      B5A2      B5A3      B5A4     B5A52.1 完全试验完全试验2.2 正交试验正交试验•可以减少试验处理，在结果分析中，每一可以减少试验处理，在结果分析中，每一种因素所起的作用能够准确反映出来。

种因素所起的作用能够准确反映出来L L4 4(2(23 3) )正交表正交表 正正 交交 试试 验验 L L4 4　　(2(23 3) )正交表正交表正交表代号正交表代号处理数处理数因子数（列号数）因子数（列号数）水平数水平数正正 交交 试试 验验 　　L L9 9(3(34 4) )半夏茎尖培养正交试验结果半夏茎尖培养正交试验结果　　L L9 9(3(34 4) )半夏茎尖培养正交试验结果半夏茎尖培养正交试验结果温度时间茎尖大小　　L L9 9(3(34 4) )半夏茎尖培养正交试验结果半夏茎尖培养正交试验结果 六、筛选组培方案应注意的问题六、筛选组培方案应注意的问题◆◆找准主导影响因子是关键找准主导影响因子是关键◆◆试验有重复，试材数量大于试验有重复，试材数量大于30，，每处理每处理10瓶，每瓶瓶，每瓶3块培养物块培养物◆◆试材须在相同培养上继代培养试材须在相同培养上继代培养3代以上，才能保证试验结果可靠代以上，才能保证试验结果可靠。