分子生物学DNA的重组与转座课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式分子生物学DNA的重组与转座1第七章 DNA的重组与转座 7.1 同源重组 7.2 位点特异性重组 7.3 转座作用 7.4 逆转录转座子分子生物学DNA的重组与转座 广义上，任何造成基因型变化的基因交流过程都叫遗传重组（genetic recombination）. 狭义上，指涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流，有时又称交换（crossing over）. 通过不同个体间的基因交换，可以保证遗传的多样性，从而为选择奠定物质基础 遗传重组包括同源重组，位点专一性重组，转座重组和异常重组分子生物学DNA的重组与转座7.1同源重组(homologousrecombination) 一、定义：同源重组也称交换，指减数分裂过程中染色体间遗传物质的交换，即在两个双螺旋DNA分子中任何一对同源序列作底物进行交换 同源重组发生在DNA 的同源序列之间在生物细胞中很普遍，如真核生物非姊妹染色体之间的交换，姊妹染色体的交换，细菌及其某些低等真核生物的转化、转导、接合等都属于同源重组分子生物学DNA的重组与转座同源重组的机制（一）、断裂复合： 减数分裂中，染色体减数分裂和配对时，在染色单体水平上发生物理断裂，断裂可通过交叉重接而解除张力，从而产生两个相互重组的染色单体。

分子生物学DNA的重组与转座（二）重组过程:由Holliday提出，后经Messelson，Radding修改，可以分为以下几个步骤.1、切断（nicking）：同源联会的两个DNA分子中任意一个出现单链切口（由某些DNA内切酶产生）2、链转换（strand displacement）：切口处形成5端局部解链，由细胞内类似于大肠杆菌DNA Pol I的酶系利用切口处的3-OH合成新链，而把原有链转换出来，使原有链成为游离的5-单链区段分子生物学DNA的重组与转座3、单链侵入（single-strand invasion）由链置换产生的单链区段侵入到参与联会的另一条DNA分子因局部解链而产生的单链泡中4、Loop切除：侵入的单链DNA与参与联会的另一条DNA分子中的互补链形成碱基配对，同时把与侵入单链的同源链置换出来，由此产生D-Loop，其单链区随后被切除降解5、链同化（strand assimilation ）Loop切除中产生的3-OH断头和侵入的单链的5-P由DNA Ligase联接，同时侵入的单链沿5-3方向继续置换，Loop切除中产生的5-P断头6、异构化：链同化过程中，DNA经过一定的扭曲旋转形成的异构体。

7、分支迁移（branch migration）：两条DNA分子之间形成的交叉点可以沿DNA移动，这一过程称为分支迁移 分子生物学DNA的重组与转座图、分枝迁移分子生物学DNA的重组与转座Holliday结构的拆分 重组体连接两个DNA双链的交换中间物含有4股DNA链，在其连接处为转换配对所形成交叉链的连接点称为Holliday结构该结构中由二对连锁在一起的DNA分子组成 Holiday中间体的形成只完成了重组的一半，由于连锁在一起的两条DNA分子必须经过拆分（resolution）回复到彼此分开的双螺旋状态拆分的方式有两种，需要内切酶在交叉点处形成一对切口，然后由连接酶连接 分子生物学DNA的重组与转座细菌DNA的重组 1、细菌重组酶： 1）RecA蛋白：为Ecoli RecA基因的产物，RecA蛋白是催化重组基本反应的酶，能通过碱基配对使两个DNA连接成杂交分子2）Rec BCD酶：亦称核酸外切酶V，它通过Chi序列识别靶位点该酶具有多种活性，可以在单链结合蛋白的存在下松开DNA双链，同时还具有ATP酶活性，它在重组中的作用是提供具有3-末端的单链区域3）ruvABC：其中ruvA和B基因产物可促进异源双链结构的形成。

分子生物学DNA的重组与转座1、单链摄入和链交换 RecA蛋白作用于DNA分子，用单链去置换双链分子的同源区段，这个反应称单链摄入RecA蛋白的这种作用是通过与游离的单链3-端结合，并引导单链DNA侵入双链DNA中，这种作用还需要RecBCD的协助 E.coli中有一种ChiKai结构： 5-GCTGGTGG-3 3-CGACCACC-5 分子生物学DNA的重组与转座RecBCD沿双链滑行至Chi结构附近时，将其附近的兔耳结构的一端切开形成具有3-端的单链区，RecA再与此单链DNA的3-端结合并引入另一双链结构中导致重组，RecBCD则沿双链继续寻找下一个Chi结构 兔耳结构：RecBCD结合DNA，使解链速度大于恢复双螺旋的速度，所以形成二个单链环，称兔耳结构 分子生物学DNA的重组与转座同源重组的作用 1、维持种群的遗传多样性 2、在真核生物中同源重组使同源染色体的染色单体间发生物理连接，这样使第一次减数分裂时同源染色体能平均分配至子代细胞中 3、有助于DNA损伤的修复，发生重组的位置常含有错配的碱基 分子生物学DNA的重组与转座7.2 位点专一性重组 特指噬菌体DNA整合到细菌染色体DNA的过程。

最早在phage的遗传学研究中发现的，DNA通过重组整合到大肠杆菌染色体的专一性位点上，转变为原噬菌体DNA的非活性状态（溶源状态）在溶菌状态时，DNA以环状分子独立存在，两种状态的转换都与位点专一性重组有关位点专一性重组不是由DNA序列的同源性所引起，仅涉及短的同源序列 整合和切除过程是在细菌DNA和噬菌体DNA专一的附着位点（attachment site , att） 上进行的，分子生物学DNA的重组与转座 细菌的附着位点称attB，由序列BOB组成，噬菌体的附着位点称attP，由序列POP组成，其中O序列为attB和attP所共有，称为核心序列重组就发生在这段序列上 在重组过程中DNA以线性形式插入细菌染色体，此时原噬菌体被重组产生的两个新的att（attL，attR）位点所固定，整合过程在attB和attP之间识别，而切除过程在attL和attP之间识别 分子生物学DNA的重组与转座Figure . Does recombination between attP and attB proceed by sequential exchange or concerted cutting? Specialized recombination involves breakage and reunion at specific sites分子生物学DNA的重组与转座Figure 14.21 Staggered cleavages in the common core sequence of attP and attB allow crosswise reunion to generate reciprocal recombinant junctions. Specialized recombination involves breakage and reunion at specific sites分子生物学DNA的重组与转座Figure . Recombination between two paired duplex DNAs could involve reciprocal single-strand exchange, branch migration, and nicking. Specialized recombination involves breakage and reunion at specific sites分子生物学DNA的重组与转座Figure . Int and IHF bind to different sites in attP. The Int recognition sequences in the core region include the sites of cutting. Specialized recombination involves breakage and reunion at specific sites分子生物学DNA的重组与转座Site-specific recombination: ( 位点专一重组）AntibodydiversityH and L are all encoded by three gene segments: V, D, J V-39bp28-D-2839bp-JTwo heavy chains (H)250155Two light chains (L)2504Enormous number (108) of different H and L gene sequences can be produced by such a recombination分子生物学DNA的重组与转座One antibody example produced by site-specific recombination分子生物学DNA的重组与转座7.3 转座重组 同源染色体上的重组比例较少，较多的还是非同源染色体间的转座重组。

原核生物，真核生物基因组中都有一些不必借助同源序列可以从一个部位移动到另一个部位的DNA片段，这些片段称转座子（transposon or transposable element）转座作用与供体和受体部位之间的序列没有任何关系 所有的转座子都有两个结构特征：其一两端有20-40bp的反向重复序列；其二转座子的中间具有编码转座酶的基因，这种酶催化转座子插入新的位置 转座子的共性：1、两端都有反向重复序列 2、具有编码转座酶的基因，催化转座子插入新的位点分子生物学DNA的重组与转座原核生物的转座（一）转座子的类型和结构特征 1、简单转座子，即插入序列（insertion sequence, IS）IS在大肠杆菌的质粒中很常见，如IS1有10个拷贝，IS可编码转座酶，是自主单位 5-GAC-CAG-3 IS的共性： 1、IS的末端为反向重复序列，15-20bp，二者可以不完全相同 2、IS转入宿主DNA序列时，使宿主DNA产生同向重复序列，靶位点长度一般为5-9bp，形成5-9bp的同向重复 分子生物学DNA的重组与转座Transposition ( 转座作用）IS element转座酶在宿主DNA上切割IS插入缺口后形成同向重复分子生物学DNA的重组与转座分子生物学DNA的重组与转座2、复合转座子：较大，由两个重复序列夹着中心区的编码其他蛋白如抗药性基因组成，通常以Tn命名。

复合转座子的重复序列就是IS，可从一个位点转座到另一个位点，或从一个复制子转座到另一个复制子二）转座子的转座机制 转座子都是具有编码与转座作用有关的酶转座酶，而转座子的末端大多数都是反同重复序列其转座机制为： 在转座酶的作用下，在转座子两端和靶位点产生切口，所形成的突出单链末端与转座子两端 的反向重复序列相连，然后由DNA聚合酶填补缺口，连接酶封闭切口分子生物学DNA的重组与转座转座作用的机制分为三种类型：复制型转座：留一个，转一个非复制型转座：直接转移保守型转座：为另一种非复制型转座，转座过程中，转座子从供体位点切除，插入到靶位点，其中每一个核苷酸都被保留下来分子生物学DNA的重组与转座FigureMutranspositiongeneratesacrossoverstructure,whichisconvertedbyreplicationintoacointegrate .1、Replicativetranspositionproceedsthroughacointegrate分子生物学DNA的重组与转座FigureNonreplicativetranspositionresultswhenacrossoverstructureisreleasedbynicking.Thisinsertsthetransposonintothetar。