医学专题—动植物细胞器离心法分离6737.ppt

实验实验4 动植物细胞器分离动植物细胞器分离(fēnlí)、制备与观察、制备与观察 I 线粒体制备与活性鉴定【目的目的】1．掌握分离(fēnlí)制备动物和植物细胞线粒体的方法2．对分离得到的线粒体进行活性鉴定原理原理】n线粒体（mitochondria）是真核细胞特有的，司能量转换的重要细胞器细胞中的能源物质——脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过藕联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需第一页，共二十六页n将动植物组织制成匀浆，在适当的悬浮介质中用差速离心法可以分离细胞(xìbāo)线粒体在一定的离心场中(选用离心机的一定转速)，球心颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度在一均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其他内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集细胞器沉降先后顺序是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子第二页，共二十六页n悬浮介质通常采用缓冲(huǎnchōng)的蔗糖溶液，它较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性；pH7.2的条件下；亚细胞组分不容易重新聚集成团，有利于分离。

整个操作过程样品要保持在0℃~4℃，避免酶失活第三页，共二十六页n细胞器标记酶的测定是评价细胞器内膜组分和分离纯度的主要依据，如线粒体内膜上分布(fēnbù)有细胞色素氧化酶，该酶使詹纳斯绿B染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色第四页，共二十六页n詹纳斯绿B是一种活体染料，能对动、植物的细胞或组织在活体状态下进行无毒害的染色由于染料(碱性染料)的胶粒表面带有阳离子，酸性染料的胶粒表面带阴离子，而被染部分本身具有(jùyǒu)阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间发生吸引作用，染料就被堆集下来染色法可以显示出活细胞内的某种天然结构存在的真实性，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以至引起细胞的死亡第五页，共二十六页鼠肝线粒体的分离鼠肝线粒体的分离(fēnlí)【材料材料】鼠肝脏或猪肝脏实验用品实验用品】1．试剂：(1) 0.25 mol／L蔗糖+0.01 mol／L三羟甲基氨基甲烷(Tris)一盐酸缓冲液(pH 7.4)： 0.1 mol／L三羟甲基氨基甲烷溶液(róngyè) 10 mL 0.1 mol／L盐酸 8.4 mL 加双蒸水到100 mL，再加蔗糖使浓度为0.25 mol／L。

2) 0.34 mol／L蔗糖+0.01 mol／L Tris一盐酸缓冲液(pH7.4)，配法同上第六页，共二十六页(3) 1％詹纳斯绿B(Janus green B)染液，称取50 mg詹纳斯绿B液溶于5mL生理盐水中，稍微加热使之溶解后，过滤，即为1％原液4) 姬姆萨染液(Giemsa)： 称取Giemsa粉0.5 g、甘油33 mL、纯甲醇(jiǎ chún)33 mL先在Giemsa粉中加少量甘油，然后在研钵内研磨至无颗粒状，再将剩余甘油倒入混匀，56℃左右保温2 h，使其充分溶解，最后加甲醇混匀，成为Giemsa原液，保存于棕色瓶使用时吸出少量用1／15mol／L磷酸缓冲液作10~20倍稀释第七页，共二十六页(5) 1／15 mol／L磷酸缓冲液 (pH 6.8)：1／15 mol／L磷酸二氢钾(KH2PO4) 50 mL1／15 mol／L磷酸氢二钠(Na2HPO4) 50 mL(6) 卡诺(kǎ nuò)(Cornay)固定液： 无水乙醇 6 mL 冰醋酸 1 mL 氯 仿 3 mL(7) 生理盐水第八页，共二十六页。

2．器具(qìjù)：n解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃匀浆器，尼龙织物(zhīwù)，刻度离心管，显微镜，冷冻高速离心机第九页，共二十六页【实验实验(shíyàn)步骤步骤】1．制备肝细胞匀浆：实验前将鼠空腹12小时，击头处死，剖腹(pōu fù)取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干水，称取肝组织2 g，剪碎；用预冷的0.25 mol／L蔗糖溶液洗涤数次然后按每克肝加4.5 mL预冷的0.25 mol／L蔗糖溶液的量，分数次添加蔗糖溶液，在0~4℃冰浴中用玻璃匀浆器将肝制成匀浆，用双层纱布过滤第十页，共二十六页2．差速离心： 将0.34 mol／L蔗糖溶液4.5mL放入离心管，然后沿管壁小心地加入4.5mL鼠肝匀浆覆盖(fùgài)于上层用冷冻控温的高速离心按下图顺序进行差速离心第十一页，共二十六页分离(fēnlí)细胞核：鼠肝匀浆700×g离心(líxīn)10 min 沉淀(细胞核及质膜碎片) 上清液(1) 洗涤(0.25 mol／L预冷蔗糖溶液5 mL洗涤2次，每次1000×g离心15 min 沉淀(细胞核及质膜碎片) 上清液(2)→与上清(1)合并第十二页，共二十六页。

分离(fēnlí)线粒体：混合上清液10000×g离心10 min沉淀(线粒体) 上清液(弃去)洗涤加预冷的0.25 mol／L蔗糖溶液(róngyè)10 mL，10000×g离心10 min沉淀(纯化的线粒体) 上清液(弃去)第十三页，共二十六页3．活性鉴定(jiàndìng)： (1) 细胞核：取核沉淀1滴涂于载玻片，加入Carnoy固定液15 min，晾干Giemsa染液染10 min，蒸馏水漂洗数秒，用滤纸吸干水、用显微镜(40×)检查(jiǎnchá)，细胞核呈紫红色，混杂的胞质为浅蓝色碎片2) 线粒体： 取线粒体沉淀滴在载玻片上，勿太密滴加1％詹钠斯绿溶液染液，10 min后用光学显微镜观察，线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状第十四页，共二十六页玉米玉米(yùmǐ)线粒体的分离线粒体的分离n从植物细胞分离线粒体，除了作线粒体功能测定外，在植物细胞遗传工程中，常用于分离核外基因—线粒体DNA等目的n分离线粒体的方法仍采用均匀(jūnyún)介质中的差速离心介质中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L甘露醇代替。

EDTA整合二价阳离子，Ca2＋除去后细胞间粘着解体，促使组织分散成单个细胞牛血清白蛋白(BSA)能包在细胞外面，并作为竞争性底物削弱蛋白酶的作用第十五页，共二十六页【材料材料】玉米黄化幼苗(水稻、高粱等幼苗均可)实验用品实验用品】1．试剂(shìjì)：（1）分离介质：0.25mol/L蔗糖，50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，3mmol/LEDTA，0.75mg/mL牛血清白蛋白(BSA) 50mmol/L的Tris-Hcl缓冲液(pH7.4)配法：50mL0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液与42mL 0.1mol/L盐酸混匀后，加水稀释至100mL第十六页，共二十六页（2）保存液：0.3mol/L甘露醇(pH7.4)（3）20％次氯酸钠(NaClO)溶液(róngyè)4）1％詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制2．器材：温箱、冰箱、纱布、瓷研钵、冷冻控温高速离心机第十七页，共二十六页【实验实验(shíyàn)步骤步骤】1．玉米种子用20％次氯酸钠溶液浸泡10min消毒，清水冲洗30min，再浸泡清水15h将种子平铺在放有湿纱布(shābù)的盘内，保持湿度，置温箱28℃于暗处培育2~3d。

待芽长到1~2cm长时剪下约15g，放0~4℃1h2．加3倍体积分离介质，在瓷研钵内快速研磨成匀浆3．用多层纱布过滤，滤液经700×g离心10min除去核和杂质沉淀4．取上清液10000×g离心10min，沉淀为线粒体再同上离心洗涤一次5．沉淀为线粒体，可存于0.3mol/L甘露醇中注意以上匀浆化及离心均控制在0~4℃进行6．线粒体的观察：取线粒体沉淀涂在清洁的载玻片上，不待干立即滴加1％詹纳斯绿B染色20min，放上盖玻片，用显微镜观察，线粒体是蓝绿色圆形颗粒第十八页，共二十六页【注意事项注意事项】n实验全过程要求在0℃~4℃进行，如果使用非冷冻控温的离心机，一般(yībān)只宜分离细胞核和线粒体，同时注意使样品保持冷冻；尽可能充分破碎组织、缩短匀浆时间整个分离过程不宜过长实验报告实验报告】n绘制线粒体示意图第十九页，共二十六页II 叶绿体的分离与荧光叶绿体的分离与荧光(yíngguāng)观察观察【目的目的】 了解叶绿体分离的一般原理和方法，并熟悉应用荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象原理原理】 叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，能发生特有的能量转换。

利用低速离心机可以分离叶绿体，其分离在等渗溶液(0．35 mol／L氯化钠或0．4 mol／L蔗糖溶液)中进行，目的是为了防止渗透压的改变引起叶绿体的损伤将匀浆液在1000 r／min离心，去除其中的组织(zǔzhī)残渣和一些未被破碎的完整细胞，然后，3000 r／min离心，可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)在室温下进行分离要迅速第二十页，共二十六页n某些物质(wùzhì)在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光若停止供能荧光现象立即停止有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光(称为自发荧光)，如叶绿素的火红色荧光有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光(称为间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光本实验利用荧光显微镜对发荧光的叶绿体进行观察第二十一页，共二十六页【材料材料】 菠莱叶片实验用品实验用品】1．试剂：蒸馏水，0.35 mol／L氯化钠溶液，0.01％吖啶橙2．器材：普通离心机，组织捣碎(dǎo suì)机，天平，荧光显微镜，显微镜，载玻片，盖玻片，镊子，接种针，目镜测微尺，物镜测微尺，恒温箱，培养皿，滤纸，试管，试管架，移液管，滴管，烧杯，无荧光载片，盖玻片，离心管。

第二十二页，共二十六页【实验实验(shíyàn)步骤步骤】1．选取新鲜的菠菜嫩叶，洗擦干后去除叶梗及粗脉，称3g于0.35 mol／L氯化钠溶液45mL中，置入组织捣碎机或研钵中2．利用组织捣碎机低速(5000 r／min)匀浆3~5 min，或研磨成匀浆3．用6层纱布过滤，滤液(lǜyè)盛于烧杯中4．取滤液4 mL在1000 r／min下离心2 min，弃去沉淀5．将上清液在3000 r／min下离心5 min．弃去上清液，沉淀即为叶绿体(混有部分细胞核)第二十三页，共二十六页6．沉淀用0.35 mol／L氯化钠溶液悬浮7．取叶绿体悬液l滴置于载玻片上，加盖玻片后用普通(pǔtōng)光学显微镜观察使用荧光显微镜观察时，将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，再滴加l滴0.01％吖啶橙荧光染料，盖上无荧光的盖玻片后即可观察8．观察叶绿体的形态结构、测量5~10个叶绿体的长轴和短轴、叶绿体发射荧光的现象第二十四页，共二十六页【实验报告实验报告】n绘制普通光学显微镜下观察的叶绿体形态示意图，记录(jìlù)荧光显微镜观察的现象，分析结果第二十五页，共二十六页内容(nèiróng)总结实验4 动植物细胞器分离、制备与观察。

依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集整个操作过程样品要保持在0℃~4℃，避免酶失活将0.34 mol／L蔗糖(zhètáng)溶液4.5mL放入离心管，然后沿管壁小心地加入4.5mL鼠肝匀浆覆盖于上层将种子平铺在放有湿纱布的盘内，保持湿度，置温箱28℃于暗处培育2~3d待芽长到1~2cm长时剪下约15g，放0~4℃1h第二十六页，共二十六页。