动物及健康人肠道共生的大肠埃希菌耐药性及产生原因分析.doc

1动物及健康人肠道共生的大肠埃希菌耐药性及产生原因分析作者：李景云 崔生辉 马越 胡昌勤【摘要 】 目的 了解目前动物和人肠道共生的大肠埃希菌耐药性，分析其产生的原因方法 从甘肃、湖北、北京、山东、四川等地相对封闭的养殖场及养殖场附近的健康人群采集鸡、猪、鱼、人粪便样本，分离大肠埃希菌用 API20E 鉴定条鉴定怀疑为大肠埃希菌的菌种，采用 KB 纸片法检测生化鉴定为大肠埃希菌的菌株的耐药性，利用 WHONET5.3 软件进行药敏试验数据分析用脉冲场凝胶电泳技术检测具有相似耐药谱型的大肠埃希菌菌株间的同源性结果 ①共收集 571 株大肠埃希菌，其中从海水养殖鱼类和淡水养殖鱼类分离 31 株，另从海水养殖鱼类和淡水养殖鱼类分离嗜水气单胞菌株 57 株；②来源鸡的大肠埃希菌对所有检测的抗菌药物的耐药率最高；③除 β 内酰胺类抗生素和阿米卡星外，鸡、猪和人来源菌株的耐药率表现为高、中、低现象，对老的一些抗菌药物和喹诺酮类抗菌药物尤其明显；不同地区分离株的耐药性也有较大的差异；④本次调查首次在国内养鸡场发现产 ESBL 大肠埃希菌，并且非常多见；⑤嗜水气单胞菌和大肠埃希菌的耐药性有较大的差异，47 株耐药谱型相近的菌株中发现了三组基因水平同源性菌株(相似度大于95%)。

结论 ①从不同地区、不同种类动物分离菌株的耐药性不同，2与抗生素的使用情况相关目前我国家禽养殖业滥用喹诺酮类和 β 内酰胺类尤其是三代头孢菌素类抗生素的现象较为普遍，应该加以严格控制；②不同菌种的生物学特性不同，导致耐药性不同；③同源性分析发现耐药菌株可在同一种类动物间传播，不同类动物的大肠埃希菌之间可能存在耐药基因的水平传播；④应当加强养殖动物分离的大肠埃希菌耐药性监测 【关键词】 大肠埃希菌； 养殖场； 抗生素； 耐药性ABSTRACT Objectives To investigate the resistant profiles of Escherichia coli, the commensal intestinal isolates from pig, chicken, fish and healthy human beings. Methods E.coli isolates were recovered from fecal specimens of chicken, pig, fish and healthy human beings collected from farms of Gansu, Hubei, Shandong, Sichuan and Beijing areas. The isolates were identified by API20E system. The antimicrobial susceptibility of these isolates were tested by K B disk diffusion method, and the data were analyzed by WHONET5.3 software. Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) were applied to identify the homogeneity of 47 E.coli isolates which showed similar antimicrobial resistance profiles. Results Totally 571 E.coli isolates were recovered, include 31 seawater 3and freshwater cultivating fish isolates. Otherwise 57 Aeromonas hydrophila isolated from seawater and freshwater cultivating fish. The chicken isolates showed the highest resistant level compared to isolates from other sources. The antimicrobials susceptibility of the isolates from chicken, pig and human were low,middling and high respectively (except beta lactams and amikacin). At the same time, the antimicrobials susceptibility of the isolates from five areas were different significantly. The extended spectrum beta lactamases (ESBLs) producing E.coli isolates were recovered from poultry farm. The resistant profiles oE.coli and Aeromonas hydrophila isolates collected from fish fecal specimens were different. With PFGE analysis, three group isolates were highly homogeneous. Conclusion Antimicrobial resistance of the isolates were widely distributed in China. The drug resistant isolates could transmit among animals of the same species, horizontal transfer of resistance genes from E.coli did occurred between animals of different species.It is important to survey antimicrobial susceptibility of the E.coli isolates from livestock farm.KEY WORDS Escherichia coli; Livestock farm; Antimicrobial; 4Resistance细菌耐药性是全球关注的热门话题，近年我国对引起人类疾病临床分离株的研究文献较多，抗菌药物在人类医学领域以外使用造成耐药性灾害的报道不多。

畜牧业抗生素的使用导致耐药株的出现，并通过食物链传播给人，对人类健康带来严重威胁［1］ 为此，国家科技部提供专项基金，由国家食品药品监督管理局细菌耐药性监测中心在我国湖北、山东、甘肃、四川和北京四省一市开展调研，现将对共生于动物及健康人肠道的大肠埃希菌的耐药性及产生的原因报告如下1 材料和方法1.1 标本采集和菌种分离鉴定(1)样本的采集 2006～2007 年在湖北恩施、山东半岛、北京门头沟、甘肃酒泉和四川新都地区各选择 2 个以上的比较封闭的养鸡场、养猪场和养鱼场，用英国 Oxoid 公司生产的采样拭子采集鸡、猪、鱼、正常人粪便样本2)细菌的分离鉴定 先采用丹麦血清所生产的肠道菌分离鉴定用琼脂平板进行大肠埃希菌的分离，用北京三药药品生物制品开发公5司生产的伊红美兰琼脂平板传纯菌株纯菌株的鉴定采用法国Bio Merieux 公司的 API20E 肠杆菌科细菌鉴定条1.2 药敏试验采用 KB 纸片法，质控菌株为大肠埃希菌 ATCC25922 和ATCC35218 由美国疾病控制中心提供大肠埃希菌和嗜水气单胞菌药敏试验方法与判定标准分别参照美国临床实验室标准化研究所(CLSI)M100 S17［2］和 M45 A［3］ 。

MH 琼脂平板购自天津金章科技开发公司药敏纸片为英国 Oxoid 产品和北京天坛药物生物技术开发公司的产品，纸片的药物含量参照 CLSI 标准产超广谱β 内酰胺酶(ESBLs) 菌株的确证采用双纸片法1.3 数据分析药敏试验数据分析采用世界卫生组织细菌耐药性监测中心推荐的WHONET5.3 软件进行1.4 菌株间同源性分析(1)主要试剂 限制性内切酶 XbaI 购自大连宝生物公司；SeaKem Gold 琼脂糖购自美国 Cambrex 公司；蛋白酶 K 为德国 Merck 公6司产品；十二烷基肌氨酸钠、Tris base、EDTA、苯甲基磺酰氟(PMSF)、硼酸等均为美国 Sigma 公司产品2)主要仪器 脉冲场凝胶电泳仪 CHEF Mapper 电泳仪和凝胶成像系统 Gel/ChemiDoc 系统均为 BIO RID 公司产品3)PFGE 操作方法参照美国 CDC 建立的 PulseNet 提供的方法4)数据分析 将 PFGE 得到的电泳图谱采用 BioNumerics 软件(ver4.0)进行分析，以不加权成对算术平均法(unweighted pair group method with arithmetic average，UPGMA)为手段进行聚类分析。

2 结果2.1 分离菌株的耐药性从甘肃、湖北、北京、山东、四川四省一市采集鸡、猪、鱼、人粪便样本共分离大肠埃希菌 571 株，其中从鸡、猪和人粪便样本分离大肠埃希菌共 540 株，它们对常规监测用抗生素的耐药性和主要耐药谱型分别见表 1 和表 2从海水养殖鱼类和淡水养殖鱼类共分7离嗜水气单胞菌 57 株和大肠埃希菌 31 株，其耐药性见表 32.2 不同地区动物、人源性大肠埃希菌产超广谱 β 内酰胺酶(ESBL)菌株分离情况经 CLSI 推荐的确证试验证明本次调查共有 65 株大肠埃希菌为产 ESBL 菌株，其中以鸡来源菌株的分离率最高，其次为人源菌株，猪分离菌株未发现产 ESBL 菌株不同地区动物、人源性大肠埃希菌产 ESBL 菌株分离情况见表 42.3 耐药性相似的大肠埃希菌菌株同源性分析采用 XbaI 作为内切酶，对来自湖北恩施地区和甘肃酒泉地区耐药表型相似的 47 株大肠埃希菌菌株进行 PFGE 同源性分析以 95%的相似度为界限，来自同一养鸡场的大肠埃希菌xiao39、xiao27、xiao35，同一养猪场的大肠埃希菌 p44 和 p60和养鸡场周围人群分离的 hj18 和 hj21b 分别为同源菌株；47 株菌可以分成 40 个 PFGE 型别， 在不同动物种群、不同地区间未 表 1 五地区鸡、猪和人来源大肠埃希菌对常规监测抗菌药物的耐药性表2 五地区鸡、猪和人来源大肠埃希菌主要耐药谱型比较表 3 从鱼分离到嗜水气单胞菌和大肠埃希菌表 4 不同地区动物/人源性大肠埃希菌产发现同一克隆株。

83 讨论大肠埃希菌是动物肠道正常菌群的一部分，在食品生产、加工和销售过程中该菌常被作为粪便污染的指示菌在畜牧养殖业过程中，无论抗菌药物是作为治疗用还是作为促生长剂用，在抗菌药物的选择性压力下，肠道细菌很易产生耐药性变化［4，5 ］ 因此，在本次养殖业中抗菌药物使用与细菌耐药性的危险评估的调查中，将大肠埃希菌作为代表菌用以研究和评估畜牧业使用抗菌药物对正常菌群耐药性的影响1)本次调查收集了甘肃、湖北、北京、山东、四川等地鸡、猪、鱼、人粪便样本大肠埃希菌 571 株，其中鸡、猪和人粪便样本大肠埃希菌 540 株耐药检测可见鸡来源的大肠埃希菌对所有检测的抗菌药物的耐药率最高除 β 内酰胺类抗生素和阿米卡星外，鸡、猪和人来源菌株的耐药率表现为高、中、低现象，对一些老抗菌药物和喹诺酮类抗菌药物尤其明显耐药表型分析也证明，鸡来源的大肠埃希菌多重耐药株更多，且更复杂据不完全统计，国内数百吨的喹诺酮类。