流式细胞仪操作步骤FACSCalibur.doc

一、开机程序：1. 检查鞘液桶和废液桶确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的 3/4位置，可以连续工作3个小时左右）、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足 够空间容纳本批标本排弃的废液如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中 气压2. 依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印 机3. 气压阀置丁加压位置，待流式细胞仪处丁 STANDB状态，做Prime,以 排除管路中气泡二、 运行FACSComp件、检查仪器状况1. 制备三色标准微球样本一般情况向1ml鞘液（或过滤PBS中加入1滴质控小微球，也可以根据实际情况调节浓度2. 机器预热5 min，打开FACSComp件，选择保持路径选择所需校 正内容，如果使用的微球是新一批产品要 输入微球的批号3. 在软件界面左侧Assay Selection 选项中选择质控类型，即实验过 程中是否需要活洗样品4. 上样品，微球溶液上样之前要充分混匀 功能键设置在“ RUN5. 仪器自动检查，并做电压、补偿等设置6. FACSComp件运行完毕，显示结果通过测试7. 做 Set up8. 打印校正结果，退出FACSComP序备注：在质控过程中，如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度， 但是在调节灵敏度（Sens）时，一定要用“LoW的状态上样，保证仪器灵敏度的准确。

在使用仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“LowTStandby” 状态三、 样品分析软件：CellQuest Pro1. 保证机器预热5 min，打开CellQuest Pro软件，选择“联机”Acquire r Connect to Cytometer（1）在弹出的界面中的选择数据存储路径（Directory 菜单）；（2） 对实验样本进行命名；（3） 对实验通道进行预设（FSC,SSC,FL1-FL4 备注：如果界面被关闭，重新调出步骤:Windows Show Browers2. 调出质控模板选择调用的质控文件Instrument SettingsBD FilesOpenOpenInstrument SettingsSet （一定要做）Done3.画图选择画图工具（一般选择散点图）,Inspect界面会自动弹出，对几个常用选项进行设定：将散点图选中（用鼠标点击散点图边框才能够选中图形），将 Analysis改为 Acquire>>Apalysis更改横纵坐标表示名称，设置十字象限如果要做四色实验，则绘制四个图备注：第一个散点图横坐标为 FSC纵坐标为SSC（1）设定获取细胞数目:AcquireAcquisition &一般获取10000个细胞。

2)调出电压、阈值和补偿等界面从工具栏 Cytometer选项中调出（1,2,3和4）(3)将所有补偿调为00Complement(4)将非52的阈值调为0Threahold(5)(6)调出细胞计数器:AcquireCounterFS兽日SS"股用线性（Lin ），激光通道（FL1-FL4） 一般用对数（Log）4. 上阴性对照将阴性对照管混匀，上机，功能键设置在“ RUN ,散点图出现细胞信号，第一个图：让细胞信号出现在自己看上去舒服的区域； 其他三个 散点图，要将细胞信号调整到阴性区域，即左下角区域通过移动通道电压来实现Acquire获取实验数据：暂停刚才实验 Pause I Abort注意：在获取细胞之前，要将Set up前面的勾子取消5.上单阳管，调节功能键“ RUN，如果细胞信号出现在双阳区域，说明有细胞信号露到相邻通道中，要将细胞信号调节到单一通道中通过移动通道补偿来实现，想要细胞信号向哪个通道移动，就用散点图中 的另一个通道去减，即想要移动的那个通道作为减数如在 FL1和 FL2两个通道组成的散点图中，细胞信号出现在双阳区域，要将细胞 信号移动到FL1通道，就要调节FL2-FL1对应的补偿，直到细胞信号 只出现在FL1通道中，这样可以消除漏到FL2通道中的信号。

备注：FL1-FITC, FL2-PE, FL3-PerCP, FL4-APC根据实验要求选择流速，按设置顺序上样6. 点击“Acquire”命令，仪器开始获取数据，并自动将数据文件保存 到规定的目录下7. 样本获取完毕，功能键设置在“ STANDBY并选择“脱机”命令8. 点击“Quit”命令，退出 CellQuest软件9. 关机：（1） 1%次氯酸，高速（Hi） “RUN 5-10 min, Acquire 如果 细胞计算器中不显示有细胞则表示管道已经干净2）用双蒸水高速（Hi） “RUN 5-10 min , Standby 5 min ,关 机四、DNA音性分析实验：一、仪器情况检测，DNA音性分析的质控用CellQuest Pro 软件进行1. （1）保证机器预热5 min,打开CellQuest Pro软件，选择“联机”Acquire * Connect to Cytometer做质控时，需要画三个图，第一个是散点图，横坐标是 FSC，纵坐标是SSC;第二个是散点图，横坐标是FL2-Width，纵坐标是FL2-Area ;第三个是直方图，横坐标是FL2-Area , 纵坐标是Counter。

做DNA倍性实验时一般使用 PI染色，所以选择用第二通道 （FL2 ）DNA 倍性分析不需要调节补偿因为属于单色实验，所以把电压界面 Four color 前的勾去掉将信号接收方式“ Log ”改为“Lin ”，DDM Pram改为“ FL2 ” 阈值使用FL2,而不是FSC去掉细胞群中粘连体，上样本，利用第二个图，调节 FL2-A和FL2-W电压，使细 胞群信号显示在横纵坐标 200位置，通常血细胞中单细胞成 45 C，粘连体体积会比单细胞 大，大概在横坐标 400位置保存质控二、DN临性分析用ModFit LT软件进行1) 打开ModFit LT软件，调出样品检测结果，(2) 选择面积(FL2-A)，选定 X轴：FL2-W Y轴：FL2-A3) 可以点击Auto选项，进行结果自动分析，也可以选择 Manuale ,人工分析FACSCalibur每日开机程序1. 检查鞘液桶，确认：鞘液充满状态(~3升)管路畅通，无扭曲2. 检查废液桶，确认：废液桶充满100ml漂白剂管路畅通，无扭曲3. 打开流式细胞仪4. 打开电脑5. 气压阀置于加压位置，并排除管路中气泡6. 做 Prime。

7. 等待机器预热5---10分钟后可开始实验FACSCalibur每日关机程序1. 用2ml10嘛释漂白剂（有效氯0.5-1%）作样品，将样品支撑架置 于旁位，以外管吸入1ml2. 将样品支撑架置于中位，以 HI RUN 5分钟3. 将样品换成蒸馆水重复1-2步,时间加倍4. 放置盛有1ml蒸馆水的试管于样品支撑架上5. 选择Standby模式5分钟后可关掉主机6. 退出所有应用软件，在关掉主机之前关闭电脑。