嗜水气单胞菌毒力因子及病害控制技术探究进展.doc

嗜水气单胞菌毒力因子及病害控制技术探究进展嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是革兰氏阴性杆 菌，隶属于弧菌科气单胞菌属，广泛存在于淡水、污水及土 壤中［1］其能引发多种水生动物的传染病，导致水产动物 出现出血症，给养殖业造成的经济损失尤为严重，是我国淡 水养殖鱼类暴发性传染病的主要病原［2］此外，嗜水气单 胞菌还是人、畜、鱼共患的致病微生物，不仅能引起动物的 全身性败血症或局部感染，而且也能引起人的急性胃肠炎、 败血症及伤口感染、中耳炎、腹膜炎等，因而受到水产学界、 兽医学界和医学界的广泛重视［3］目前，国内外学者在对 嗜水气单胞菌毒力因子及病害控制技术方面已取得了一定 研究进展，该文对其研究现状进行综述1致病因子嗜水气单胞菌产生危害的毒力因子主要有外毒素 (exotoxin)、胞外蛋白酶(extracelluar protease)、S 层 蛋白(STayer protein)、菌毛(fimbriae)、外膜蛋白(out-membrane pro~teins， OMPs )、 脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS)等［4］该文将这些毒力因子 归纳为外毒素、胞外产物和粘附因子3类，现逐一论述如下。

1. 1 外毒素(exotoxin)1. 1. 1溶血素(hemolysin)o出血是变温动物感染嗜水 气单胞菌的普遍症状［5］由于在被感染鱼类的体内、体外 均可检测到溶血活性，所以溶血素被认为是嗜水气单胞菌的 主要毒力因子之一龚晖等［6］用纯化溶血素分别与1%欧洲 鳗鑼血红细胞、1%兔血红细胞、1%羊血红细胞进行溶血特性 分析，并利用单克隆抗体进行溶血抑制试验，结果表明嗜水 气单胞菌溶血素在单因子条件下与嗜水气单胞菌ECPs的溶 血特性存在一定的差异嗜水气单胞菌ZNl-ECPs中存在多 种溶血性毒素，这些毒素对不同宿主的溶血能力存在差异， 同一嗜水气单胞菌菌株对不同的宿主起主要作用的溶血性 毒素也不同Goswami et al ［7］首次报道致病菌暴露在碑外源物质的情况下会抑制嗜水气单胞菌的溶血性和细胞毒性1. 1. 2气溶素(aerolysin)o aer毒素是嗜水气单胞菌 的重要的毒力因子它是一个分子量约为52. 25 kD的单个 分子的多肽，具有溶血性、细胞毒性、肠毒性，决定嗜水气 单胞菌致病性的强弱朱建萍等［8］从三角帆蚌体内分离出 10株嗜水气单胞菌分离株并进行PCR法检测，结果证实aer 基因携带率为50%o经过对症状进行对比后发现，分离自感 染症状严重的三角帆蚌体内的5株嗜水气单胞菌均携带气 aer基因，分离自轻度感染的三角帆蚌体内的5株嗜水气单 胞菌未检测到aer基因，这也说明aer是嗜水气单胞菌的重 要致病因子。

1. 1. 3 肠毒素(cytolyticenterotoxin)0 肠毒素是一种 分子量为15 kD的蛋白质用鼠和兔的肠绊试验检测其腹泻 性毒性，其在兔的肠绊不引起黏膜损伤，但会导致液体积聚, 所聚积液体的电解质内容和霍乱作用的结果相似其可增加 肠细胞分泌，但是未发现增加cGMP分泌肠道内的嗜水气 单胞菌导致的腹泻性病，容易为抗菌素抑制研究表明，动 物在大量感染嗜水气单胞菌时，肠道内肠毒素量大，与细胞 不可逆结合，使体液大量损失，导致死亡［9］1.2胞外产物1. 2. 1 胞外蛋白酶(extracelluar protease)o 嗜水气 单胞菌的胞外蛋白酶也是主要的致病因子之一，能够直接引 起宿主组织损伤，有利于细菌的入侵和营养供给，其存在与 否直接与菌株毒力相关储卫华等［10］证明胞外蛋白酶具有 致病性但Case 6 n et al［ll］分别克隆了嗜水气单胞菌的 胞外淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶及磷脂酶，认为就其致病性而 言，胞外蛋白酶有的具有直接致病性，有的则不具有直接致 病性引起这种差异的原因可能是蛋白酶不仅可以协同其他 毒力因子共同作用机体，而且还具有活化其他致病因子的作 用嗜水气单胞菌分泌的外毒素是以无活性的前提形式存在 的，必须经过蛋白酶作用将前体C末端的蛋白降解才能发挥 生物学活性。

因此，有些蛋白酶虽然没有直接的致病性，但 其可以借助其他的毒力因子发挥作用一般认为热稳定金属 蛋白酶有直接的致病性，而热敏感丝氨酸蛋白酶则没有直接 的致病性1. 2. 2 磷脂酶基因(Phospholipase gene)Merino et al[12]从嗜水气单胞菌AH-3克隆测序了磷脂酶Al基因pla 和磷脂酶C基因plco2个克隆基因pSK-PLA(pla)和pSK-PLC (pic)的测序结果分别为2 602、2 868 bp, pSK-PLA含有 一个ORF (176-2591)，编码805个氨基酸，分子量82. 7kD； pSK-PLC含有一个ORF (885-2691),编码572个氨基酸，分 子量为64. 8 kDo 2个基因在GenBank中的序列号分别为 AF092033和AF092034磷脂酶A1和磷脂酶C具有不同的磷 酯酶活性，前者只具有PLA1活性，没有溶血性、细胞毒性 和肠毒性；后者具有细胞毒性，没有溶血性或溶血性很弱 磷脂酶C是嗜温性气单胞菌的一个重要的致病毒力因子1.3粘附因子细菌感染宿主的第一步就是粘附，病原菌通过粘附因子 在合适宿主的特定组织或体表上定植而不被机体清除掉，从 而有利于细菌在机体内增殖并产生毒性。

嗜水气单胞菌的粘 附因子包括菌毛(fimbriae)、S层蛋白(S-layer protein)、 脂多糖(LPS)和外膜蛋白(OMP)o Ottaviani et al[13]研 究表明，生长温度影响嗜水气单胞菌的粘附性1. 3. 1菌毛(fimbriae)菌毛根据形态的不同可以分为 W (wavy)菌毛和R (ragid)菌毛W菌毛长而易弯曲呈波 浪状，菌毛数量虽少，但与嗜水气单胞菌的粘附及血凝作用 有关R菌毛短而硬，数量多周身分布，与细菌的自凝作用 有关，与血凝作用无关，不是粘附素朱兴国等［14］通过嗜 水气单胞菌与HEP-2细胞进行粘附和粘附抑制试验，结果表 明抗4型菌毛抗体可抑制80%的嗜水气单胞菌对HEP-2细胞 的粘附，说明4型菌毛能介导嗜水气单胞菌的粘附过程1. 3. 2S层蛋白(STayer protein)许多病原菌在菌体 外表面具有一层晶格状排列的结构，称为S层S蛋白是组 成其S层的蛋白亚单位，有规则地排列在菌体表面，完整地 包裹着菌体，具有抗吞噬、抗补体等作用结合国内外研究 结论，S蛋白的相对分子量在51. 5 kD左右，由天门冬氨酸 等16种氨基酸组成，其中疏水性氨基酸占35%〜42%,酸性 氨基酸的比例高于碱性氨基，不含半胱氨酸［15］。

而许冬青 等［16］用自制兔抗AhJ21株S蛋白抗体建立间接ELISA法， 检测结果显示，20〜30 h S蛋白表达量较高证明AhJ21株 纯化的S蛋白含有天门冬氨酸等16种氨基酸，并且发现不 同菌株S蛋白N端序列之间无同源性，说明不同毒株S蛋白 的免疫原性有所不同1.3.3脂多糖(LPS)o脂多糖是嗜水气单胞菌的内毒素, 表现的毒性作用主要有热原性、白细胞数目减少或增多、弥 漫性血管内凝血、神经症状及休克以至死亡等除了毒性作 用外，其中抗原脂多糖还具有粘附因子的作用［17］,而且一 些脂多糖与OMP形成的复合物还与血凝性和细胞粘附有关 因此，细菌具有很强的改变代谢的能力，以适应变化的环境, 如温度、pH、渗透压、营养等细菌的外膜（主要是LPS起 主要作用）是用来改变代谢的主要结构，通过它来调节适应 各种变化改变OMPs成分的能力使得致病菌能快速适应寄 主体内的环境，从而逃避寄主的防御系统［18］Abdel-Aziz et al ［19］研究结果表明，肌醇六磷酸酯能起到降低嗜水气单 胞菌脂多糖毒力的作用1.3.4外膜蛋白（OMP）外膜蛋白是革兰氏阴性菌外膜 的主要结构，含有多种蛋白成分，是嗜水气单胞菌重要的粘 附因子和保护性抗原，与细菌的毒力也密切相关。

根据其分 子量大小可以分为22、31、38. 43、50 kD 5种，其数量和 种类随着菌株的不同而不同近年来，刘明智等［20］研究发 现外膜蛋白中的一类微孔蛋白一OmpW基因在克隆后具有良 好的免疫原性，这为嗜水气单胞菌基因工程亚单位疫苗的研 制提供了新的思路，也将引起外膜蛋白研究的新热潮2嗜水气单胞菌危害控制嗜水气单胞菌可引起软体动物、淡水鱼类、两栖类、爬 行类、鸟类及哺乳动物等多种动物全身性败血症或局部感 染，并常致动物死亡近年来对水产养殖动物的危害尤为严 重，已成为养殖甲鱼、鲤鱼、罗非鱼、河蟹、牛蛙等的常见 病目前，对于嗜水气单胞菌的病害控制主要有免疫控制、 药物控制和生态控制3个方面2. 1免疫控制水产养殖上主要有2类疫苗：一类是由灭活的病原组成, 另一类为弱毒病原灭活的疫苗是由死的病原或病原的一些 成分如细菌脂多糖或灭活的毒素组成的，能刺激动物的免疫 系统弱毒疫苗含有减毒的活病原，能诱导特异性抗体，并 与自然感染相似而后者由于存在病原恢复毒力的风险而限 制使用在疫苗中使用的抗原主要是热灭活或福尔马林灭活 的细菌孟小亮等［21］用嗜水气单胞菌分别制备了 FAh、LPS 和OMP种疫苗，并且采用比较其免疫原性的方法证明了 3种 疫苗具有相同的免疫原性，并且测得细胞吞噬活性、细胞内 杀菌活性、体液抗体水平均显著高于对照组。

李圆圆等［22］ 用0. 30%福尔马林灭活西伯利亚歸菌株XI,将其制成灭活全 菌苗，对西伯利亚歸进行注射免疫研究结果表明，在嗜水 气单胞菌XI全菌苗中加入弗氏不完全佐剂(Freund' s incompleted adjuvant, FIA)后，XI全菌苗对西伯利亚鱼寻 的免疫保护率由50%提升到70%陶家发等［23］从患溃疡病 的缴鱼肾脏中分离得到嗜水气单胞菌GYK1,证明用0. 30%甲 醛(37 °C, 24 h)可完全灭活菌液，制备的疫苗安全性良 好，效力合格，并建立了嫩鱼致病性嗜水气单胞菌灭活疫苗 原液的生产工艺，缩短了培养时间，降低了甲醛液灭活浓度, 减少了灭活疫苗原液的甲醛残留20世纪90年代又出现了亚单位疫苗、DNA疫苗、合成 肽疫苗等新型鱼用疫苗，孙建和等［24］研制了嗜水气单胞菌 亚单位疫苗，但是仅处于实验室阶段DNA疫苗易于构建、 制备和大量生产，具有高效的免疫效果，但是鱼用DNA疫苗 对环境会产生一定负面影响，而且操作费时费力，在实际生 产中不宜应用［25］ o2. 2药物控制邓国成等［26］用从出血的草鱼中提取的2株嗜水气单胞 菌菌株进行细菌药敏试验，结果发现2个菌株对喳诺酮类药 物（环丙沙星、诺氟沙星和氧氟沙星等）高度敏感，对氨基 糖昔类抗生素（链霉素、新霉素）不敏感。

石亚素等［27］在 对从甲鱼中分离的嗜水气单胞菌的抗菌药物的敏感性试验 中研究证明，嗜水气单胞菌对先锋V、洁霉素、氯霉素部分 耐药，对痢特灵、氨基昔类、喳诺酮类、第三代头鞄菌素类 等药物100%敏感李爱华等［28］研究认为嗜水气单胞菌对青 霉素类和头起菌素类药物全部具有耐药性，对万古霉素多数 都不敏感2.3生态控制20世纪80年代以来，由于抗生素所产生的耐药性问题, 导致动物体内菌群失调问题以及其本身的残留性问题越来 越严重，使消费者对水产品的安全性产生了信任危机益生 菌(probiotics)利用微生物来调节动物体内的微生态平衡, 具有恢复机体正常生理功能、防治病害、增进健康、无抗药 性、无残留的优势，从而引起越来越多的关注早在1965 年，L订ly et al[29]就将益生菌定义为“可以促进另一微 生物生长的微生物”，这和抗生素的定义恰好相反1974年, Parker[30]将益生菌定义为“能够有助于调节肠道微生物 平衡的生物体或物质”，但并。