过氧化物酶PPT课件.ppt

实验二实验二 过氧化物酶活性的测定过氧化物酶活性的测定2024/9/13一、实验目的一、实验目的1.学习红薯过氧化物酶的制备方学习红薯过氧化物酶的制备方法2.掌握过氧化物酶的反应原理及掌握过氧化物酶的反应原理及测定方法测定方法2024/9/13二、实验原理二、实验原理 1、过氧化物酶（简称、过氧化物酶（简称POD)简介简介 过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶它与呼吸作用、光合作用及生较高的一种酶它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系在植物生长发育过程长素的氧化等都有关系在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化一般老化组织中活中它的活性不断发生变化一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱这是因为过氧性较高，幼嫩组织中活性较弱这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。

过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标此外，过氧化物同工酶在遗传育种中的重要作此外，过氧化物同工酶在遗传育种中的重要作用也正在受到重视用也正在受到重视2024/9/13•2．酶活力测定．酶活力测定•(1) 酶活力酶活力 •表示酶量的多少不能像一般物质那样，用重量表示酶量的多少不能像一般物质那样，用重量(g)或体积或体积(ml)因为酶是一种生物催化剂因为酶是一种生物催化剂酶的存在和含量多少应体现在催化能力大小，即的存在和含量多少应体现在催化能力大小，即用酶活力用酶活力(活性活性)表示•酶活力（酶活性）指酶催化某一特定化学反应酶活力（酶活性）指酶催化某一特定化学反应的能力催化能力强的能力催化能力强(大大)，酶活力就高，酶活力就高(大大)，也，也表示酶量多酶本身的重量不能说明酶的实际表示酶量多酶本身的重量不能说明酶的实际含量多少同样重量的酶，酶活力可以不同，含量多少同样重量的酶，酶活力可以不同，活力高，价值就大活力高，价值就大2024/9/13•(2) 酶促反应速度酶促反应速度•酶活力具体用它所催化的某一化学反应的反应速酶活力具体用它所催化的某一化学反应的反应速度来表示，即在最适条件下度来表示，即在最适条件下(最适最适pH、最适、最适T) 酶酶催化的反应速度愈快，酶活力就愈高。

速度愈墁，催化的反应速度愈快，酶活力就愈高速度愈墁，酶的活力就愈低所以测定酶的活力酶的活力就愈低所以测定酶的活力(实质上就是实质上就是酶的定量酶的定量)测定就是测定酶促反应的速度测定就是测定酶促反应的速度(用用v表示表示) •酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物增加量来表示单位：浓度的减少量或产物增加量来表示单位：浓度/单位单位时间时间•常用产物增加量表示，因为它从无到有，变化明常用产物增加量表示，因为它从无到有，变化明显酶促反应随时间增加，产物增加酶促反应随时间增加，产物增加 2024/9/13若将产物浓度对反应时间作图得到酶促反应若将产物浓度对反应时间作图得到酶促反应的速度曲线的速度曲线 Vmax时间时间产产物物的的生生成成量量斜率＝浓度斜率＝浓度/时间＝时间＝V2024/9/13•从图可知，反应速度只在最初一段时间内保从图可知，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶反应速度持恒定，随着反应时间的延长，酶反应速度逐渐下降引起下降的原因很多，如底物浓逐渐下降引起下降的原因很多，如底物浓度降低，产物浓度增加而加速了逆反应的进度降低，产物浓度增加而加速了逆反应的进行，产物对酶有抑制作用等。

因此研究酶反行，产物对酶有抑制作用等因此研究酶反应速度以酶促反应的初速度为准，即酶促反应速度以酶促反应的初速度为准，即酶促反应最初的一段时间，产物呈线性增加时的反应最初的一段时间，产物呈线性增加时的反应速度具体指酶促反应速度曲线的斜率具体指酶促反应速度曲线的斜率即从原点对曲线作切线，求切线斜率即从原点对曲线作切线，求切线斜率( v ) = 浓度浓度 / 时间时间2024/9/13•由于产物从无到有，只要方法灵敏，可由于产物从无到有，只要方法灵敏，可准确测定测定产物增加量的方法很多：准确测定测定产物增加量的方法很多：•化学方法：滴定、比色、气体测压、电化学方法：滴定、比色、气体测压、电化学等•物理方法：物理方法：UV吸收、荧光等吸收、荧光等•同位素方法等同位素方法等2024/9/13•(3) 酶的活力单位酶的活力单位•表示酶活力大小，也就是酶量的大小的单位表示酶活力大小，也就是酶量的大小的单位称酶的活力单位称酶的活力单位(U)•国际单位国际单位(IU)定义：定义：1个酶活力单位，是指个酶活力单位，是指在特定条件下，在在特定条件下，在1分钟内能转化分钟内能转化1微摩尔微摩尔( µmol)底物的酶量，或是转化底物的酶量，或是转化1微摩尔底物中微摩尔底物中的有关基团的酶量。

的有关基团的酶量2024/9/133、测定原理、测定原理 过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物，此化合物进一步应，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物本实验以邻甲氧基苯酚（即愈创化合物本实验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在此酶存在木酚）为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，下，H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的的4-邻甲氧基苯酚，其反应为：邻甲氧基苯酚，其反应为：2024/9/13本实验用紫外吸收法测定产物本实验用紫外吸收法测定产物4－邻甲氧基苯酚在－邻甲氧基苯酚在470nm光吸收增加值表示产物增加量，划出光吸收光吸收增加值表示产物增加量，划出光吸收 - 时间的速度时间的速度曲线，求出曲线的斜率，即酶促反应初速度，再换算为曲线，求出曲线的斜率，即酶促反应初速度，再换算为酶活力42024/9/132134567800 2 4 6 8反应时间 （分钟）生成物光吸收0.400.300.200.102024/9/132. pH对酶促反应速度的影响对酶促反应速度的影响(1) 影响酶促反应速度的因素影响酶促反应速度的因素* 底物浓度底物浓度 米氏公式米氏公式* 温度温度* 酶浓度酶浓度* 激活剂、抑制剂激活剂、抑制剂* pH2024/9/13•(2) pH对酶促反应速度的影响对酶促反应速度的影响•大多数酶的活力受其环境大多数酶的活力受其环境pH影响。

这是因影响这是因为为pH影响底物分子和酶分子中一些基团的影响底物分子和酶分子中一些基团的解离，这些基团的离子化状态关系到底物解离，这些基团的离子化状态关系到底物与酶的结合、酶的专一性和酶活性中心的与酶的结合、酶的专一性和酶活性中心的构象通常各种酶只有在一定构象通常各种酶只有在一定pH范围内才范围内才具有活性，并在一定具有活性，并在一定pH下，酶促反应具有下，酶促反应具有最大反应速度，此最大反应速度，此pH称最适称最适pH，高于或低，高于或低于此值反应速度都下降于此值反应速度都下降 2024/9/13•如将反应速度对如将反应速度对pH作曲线，典型的呈钟罩作曲线，典型的呈钟罩形，但不同酶受形，但不同酶受pH影响是不同，所以会有影响是不同，所以会有不同形状，有的只有钟罩形的一半，有的则不同形状，有的只有钟罩形的一半，有的则是一直线，即受是一直线，即受pH影响不大影响不大2024/9/13木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶胆碱脂酶胆碱脂酶2024/9/13•不同酶的最适不同酶的最适pH也不同，如胃蛋白酶为、也不同，如胃蛋白酶为、胰蛋白酶为胰蛋白酶为pH 8但应注意最适但应注意最适pH不是特不是特征常数，对于同一种酶，其最适征常数，对于同一种酶，其最适pH因底物因底物的种类、浓度及缓冲液成份不同而有差异，的种类、浓度及缓冲液成份不同而有差异，因此酶的最适因此酶的最适pH并不是一个常数，只是在并不是一个常数，只是在一定条件下才有意义。

一般最适一定条件下才有意义一般最适pH在在6 - 8之间•由于酶活力受由于酶活力受pH影响很大，因此在测定酶影响很大，因此在测定酶活力时，活力时，pH必须恒定，所以测活反应最好必须恒定，所以测活反应最好在缓冲液体系中进行在缓冲液体系中进行2024/9/13•本实验测定三亇不同本实验测定三亇不同pH下过氧化物酶的下过氧化物酶的时间－光吸收关系曲线，比较三亇不同时间－光吸收关系曲线，比较三亇不同pH ( 6.0,7.0,8.0)条件对过氧化物酶活力的条件对过氧化物酶活力的影响2024/9/13三、实验操作三、实验操作1、过氧化物酶粗品液的制备、过氧化物酶粗品液的制备①①称取红薯材料称取红薯材料1g，加少许石英砂及磷酸缓，加少许石英砂及磷酸缓冲液（冲液（2ml左右左右) ，于研钵中研磨成匀浆于研钵中研磨成匀浆②②再加入再加入3ml磷酸缓冲液浸提磷酸缓冲液浸提20分钟后，以分钟后，以6000r/min离心离心15分钟③③倾出上清液并过滤，然后转入倾出上清液并过滤，然后转入10ml容量瓶容量瓶定容，摇匀后，贮于冷处备用定容，摇匀后，贮于冷处备用 2024/9/13•2、、 酶活力测定酶活力测定 • (1)取取1只比色杯洗净控干，按以下步骤操作：只比色杯洗净控干，按以下步骤操作：•用移液管吸取用移液管吸取0.1 mol/L反应液反应液 加入比色杯中。

加入比色杯中•放入紫外分光光度计比色杯架内，按放入紫外分光光度计比色杯架内，按auto zero，出现插入空白，按，出现插入空白，按ok，仪器自动调零调零，仪器自动调零调零完成后按完成后按start，出现插入样品出现插入样品•(2)取出比色杯，取出比色杯，1人加酶液人加酶液(µL)，先加，先加20 µL ，，另另1人同时按人同时按ok开始计时，加酶后盖上硫酸纸，开始计时，加酶后盖上硫酸纸，按紧混匀，按紧混匀，30秒内放入比色杯架内，仪器每秒内放入比色杯架内，仪器每30秒自动记录光吸收值秒自动记录光吸收值A470nm•(3)按数据处理中的数据打印，显示按数据处理中的数据打印，显示8个数据，个数据，记录数据记录数据2024/9/13•(4)操作要点：操作要点：•* 关键是酶稀释的倍数和酶量多少要合适，关键是酶稀释的倍数和酶量多少要合适，使使ΔA470nm在，即第在，即第1个个30秒秒A470nm在过低过高都应增加或减少酶量重新做过低过高都应增加或减少酶量重新做•* 加酶后应迅速摇匀，立即计算时间，加酶后应迅速摇匀，立即计算时间，2人人要配合好，计时不能提前或推后，否则曲要配合好，计时不能提前或推后，否则曲线不是从原点开始。

线不是从原点开始•* 每次测定前务必洗净比色杯，用去离子水每次测定前务必洗净比色杯，用去离子水冲洗冲洗5遍以上，保证不残留上次的溶液，否遍以上，保证不残留上次的溶液，否则影响测定则影响测定2024/9/13四四. 数据处理数据处理•1. 用坐标纸作出时间用坐标纸作出时间 – A470nm曲线，过原曲线，过原点在直线部分作切线，求斜率点在直线部分作切线，求斜率ΔA470nm /min 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 时间时间/min 1A470nm2024/9/13•2. 代入下式计算酶活力代入下式计算酶活力• ΔA470nm /min·VPOD活力单位（活力单位（μmol/min））= ———————————— • ε·L • ΔA470nm /min·3 mL• = ————————————• 26.6 mL/ µmol cm·cm• ΔA470nm × 3• = ————————(μmol/min)•V 反应液体积反应液体积 ( mL )•ε 产物产物4—邻甲氧基苯酚的摩尔消光系数邻甲氧基苯酚的摩尔消光系数26.6 L/ mmol·cm 即即26.6 mL/ µmol·cm)•L 比色杯光径比色杯光径 (1cm)2024/9/13实验三实验三 POD蛋白浓度测定蛋白浓度测定 和比活力计算和比活力计算 2024/9/13一一.实验目的实验目的•1.学习学习Folin酚法（酚法（Lowry法）测法）测定定POD蛋白浓度的原理和方法蛋白浓度的原理和方法•2.掌握比活力计算方法掌握比活力计算方法2024/9/13二二.实验原理实验原理1．．Folin酚法原理酚法原理 Folin酚试剂由两种试剂组成：酚试剂由两种试剂组成： 甲试剂：双缩脲试剂甲试剂：双缩脲试剂 尿素加热至尿素加热至180℃左右，两分子尿素缩左右，两分子尿素缩合放出一分子氨，而形成双缩脲。

合放出一分子氨，而形成双缩脲 2024/9/13 NH2 ╱ ╱ NH2 C = O ╱ ╱ ╲ ╲ C = O NH2 180℃ ╲ ╲ NH + NH3↑ ╱ ╱ NH2 C = O ╱ ╱ ╲ ╲ C = O NH2 ╲ ╲ NH22024/9/13•双缩脲在碱性溶液中与铜离子（酒双缩脲在碱性溶液中与铜离子（酒石酸钾钠石酸钾钠-CuSO4）络合生成复杂）络合生成复杂的紫红色化合物。

的紫红色化合物•蛋白质分子中的肽键（蛋白质分子中的肽键（—CO—NH—）与双缩脲结构相似，也有）与双缩脲结构相似，也有双缩脲反应，其颜色深浅与蛋白质双缩脲反应，其颜色深浅与蛋白质的含量成正比，因此所有蛋白质或的含量成正比，因此所有蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，二肽以上的多肽都有双缩脲反应，可用作蛋白质定性、定量分析可用作蛋白质定性、定量分析2024/9/13 甲试剂实质是利用蛋白质中肽甲试剂实质是利用蛋白质中肽键反应进行定量测定，它与蛋键反应进行定量测定，它与蛋白质分子量及氨基酸组成无关，白质分子量及氨基酸组成无关，即受蛋白质氨基酸的特异性影即受蛋白质氨基酸的特异性影响较少但灵敏度较低，响较少但灵敏度较低，mg级级水平，水平，0~10 mg/mL作标准曲线作标准曲线2024/9/13 乙试剂：主要起作用是磷钼酸（磷钨酸），它由钼酸钠乙试剂：主要起作用是磷钼酸（磷钨酸），它由钼酸钠（钨酸钠）在酸性（磷酸等）作用下产生钨酸钠）在酸性（磷酸等）作用下产生 钼酸钠（钨酸钠）钼酸钠（钨酸钠） ∣ ∣ ↓HCl 碱性碱性 H3PO4 + 钼酸（钨酸）钼酸（钨酸） 磷钼酸磷钼酸 钼兰（钨兰）钼兰（钨兰） （磷钨酸）还原剂（磷钨酸）还原剂 2024/9/13 H3PO4 + 12H2MoO4 → H3Mo12PO40 + 12H2O 碱性↓还原剂 Mo2O3•MoO3 兰色2024/9/13 Folin酚试剂最初由酚试剂最初由Folin等于等于1912年年提出，当时只有乙试剂应用于酚类提出，当时只有乙试剂应用于酚类测定，以后才用于蛋白质测定。

因测定，以后才用于蛋白质测定因为为Tyr的酚基也能起还原剂作用，呈的酚基也能起还原剂作用，呈兰色反应，因而被利用于测定蛋白兰色反应，因而被利用于测定蛋白质，产物颜色深浅与被测蛋白质含质，产物颜色深浅与被测蛋白质含量成正比关系，所以乙试剂作用是量成正比关系，所以乙试剂作用是利用蛋白质中利用蛋白质中Tyr、、Try、、Cys等具有等具有还原性的氨基酸残基的作用进行测还原性的氨基酸残基的作用进行测定，灵敏度高，但是后来发现有些定，灵敏度高，但是后来发现有些缺点，出现不少改良方法缺点，出现不少改良方法2024/9/13 1951年年Lowry（劳里）在（劳里）在 Folin酚试剂酚试剂 中中引入双缩脲反应（加入甲试剂）即成为引入双缩脲反应（加入甲试剂）即成为如今广泛被使用的如今广泛被使用的Lowry法 为什么要作这样改良？为什么要作这样改良？ Folin酚试剂中只有乙试剂，依赖蛋白质酚试剂中只有乙试剂，依赖蛋白质中中Tyr、、Trp等氨基酸残基的反应，而对等氨基酸残基的反应，而对于不同种类蛋白质，由于它们之间的氨于不同种类蛋白质，由于它们之间的氨基酸组成不同，在呈色反应中就会有差基酸组成不同，在呈色反应中就会有差异，影响实验准确度，即受蛋白质特性异，影响实验准确度，即受蛋白质特性影响较大，而双缩脲试剂是利用肽键反影响较大，而双缩脲试剂是利用肽键反应，不受氨基酸组成的影响。

应，不受氨基酸组成的影响2024/9/13 引入双缩脲试剂后，具有两种试剂双重引入双缩脲试剂后，具有两种试剂双重作用，互相补充，结果大大增加了反应作用，互相补充，结果大大增加了反应的灵敏度和准确度的灵敏度和准确度Lowry法较双缩脲法较双缩脲灵敏度提高灵敏度提高100倍，较倍，较UV法灵敏法灵敏10~20倍 Folin酚（酚（Lowry）法，灵敏度高，操）法，灵敏度高，操作简单，迅速，不需要特殊仪器，常用作简单，迅速，不需要特殊仪器，常用作蛋白质定量测定，文献引用最多作蛋白质定量测定，文献引用最多2024/9/13 方法方法 灵敏度灵敏度 时间时间 原理原理 干扰物质干扰物质 说明说明凯氏定氮法凯氏定氮法（（Kjedahl法）法）灵敏度低，适灵敏度低，适用于用于0.2～～1.0mg/ml氮，误差为氮，误差为  2％％费时费时 8～～10小时小时蛋白质（平均含氮蛋白质（平均含氮量量16％）经过硫酸％）经过硫酸消化，强碱碱化，消化，强碱碱化，吸收并滴定，准确吸收并滴定，准确测定氮量测定氮量非蛋白氮（可用非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）白质而分离）用于标准蛋白质用于标准蛋白质含量的准确测含量的准确测定；干扰少；费定；干扰少；费时太长时太长双缩脲法双缩脲法（（Biuret法）法）灵敏度低灵敏度低310nm比色比色0.1～～1.0mg/ml540nm比色比色1～～10mg/ml中速中速 20~30分钟分钟多肽键＋碱性多肽键＋碱性Cu2＋＋紫色络合紫色络合物物硫酸铵；硫酸铵；Tris缓冲液；缓冲液；某些氨基酸某些氨基酸用于快速测定，用于快速测定，但不太灵敏；不但不太灵敏；不同蛋白质显色相同蛋白质显色相似似紫外吸收法紫外吸收法较为灵敏较为灵敏0.1～～1.0mg/ml快速快速 5～～10分钟分钟蛋白质中的酪氨酸蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在和色氨酸残基在280nm处的光吸收处的光吸收各种嘌吟和嘧各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸啶；各种核苷酸用于层析柱流出用于层析柱流出液的检测；核酸液的检测；核酸的吸收可以校正的吸收可以校正Folin－酚试剂－酚试剂法（法（Lowry法）法）灵敏度高灵敏度高0.03～～5 g慢速慢速 40～～60分钟分钟双缩脲反应；磷钼双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被酸－磷钨酸试剂被Tyr和和Phe还原还原硫酸铵；硫酸铵；Tris缓冲液；缓冲液；甘氨酸；甘氨酸；各种硫醇各种硫醇耗费时间长；操耗费时间长；操作要严格计时；作要严格计时；颜色深浅随不同颜色深浅随不同蛋白质变化蛋白质变化考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法(Bradford法法)灵敏度最高灵敏度最高1～～5 g快速快速5～～15分钟分钟考马斯亮蓝染料与考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其蛋白质结合时，其 max由由465nm变变为为595nm强碱性缓冲液；强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS 最好的方法；最好的方法； 干扰物质少；干扰物质少； 颜色稳定；颜色稳定； 颜色深浅随不同颜色深浅随不同蛋白质变化蛋白质变化2、蛋白质的定量测定、蛋白质的定量测定2024/9/13•3.比活力概念比活力概念•比较不同重量或不同蛋白含量的酶活力并无实际比较不同重量或不同蛋白含量的酶活力并无实际意义，不同酶或同一种酶在不同情况下的比较应意义，不同酶或同一种酶在不同情况下的比较应有一个重量标准，于是产生出另一个酶的重要参有一个重量标准，于是产生出另一个酶的重要参数数——比活力。

比活力•比活力比活力 指单位质量的酶蛋白所具有的酶活力指单位质量的酶蛋白所具有的酶活力•单位单位 酶活力单位酶活力单位 / mg酶蛋白酶蛋白 ( IU / mg酶蛋白酶蛋白 )•比活力是酶学研究及酶制剂生产制备中经常使用比活力是酶学研究及酶制剂生产制备中经常使用的数据，用来比较单位重量酶蛋白的催化能力的数据，用来比较单位重量酶蛋白的催化能力( 即即酶活力大小酶活力大小 )2024/9/13 比活力实际意义比活力实际意义 可以说明酶的质量好坏，纯度高可以说明酶的质量好坏，纯度高低不同酶比较时，比活力高，说明其质量好，低不同酶比较时，比活力高，说明其质量好，纯度高；对同一种酶，可以比较不同批次的质量纯度高；对同一种酶，可以比较不同批次的质量和纯度在酶的生产制备过程，考察比活力尤为和纯度在酶的生产制备过程，考察比活力尤为重要，随着该酶不断被提纯，它的比活力升高，重要，随着该酶不断被提纯，它的比活力升高，说明酶逐步被纯化，比如，粗制品总活力很高，说明酶逐步被纯化，比如，粗制品总活力很高，蛋白质含量也很高蛋白质含量也很高(杂蛋白多杂蛋白多)，比活力低纯化后，比活力低。

纯化后虽然总活力降低，但蛋白质含量也因大量杂蛋白虽然总活力降低，但蛋白质含量也因大量杂蛋白被除去而减少，使比活力升高酶愈纯，比活力被除去而减少，使比活力升高酶愈纯，比活力愈高，比活力不再升高，酶就相当纯了，因此比愈高，比活力不再升高，酶就相当纯了，因此比活力用以衡量生产工艺优劣、生产效率高低它活力用以衡量生产工艺优劣、生产效率高低它是一个很有实际用途的参数，是经常要测定的数是一个很有实际用途的参数，是经常要测定的数据2024/9/13三、操作步骤三、操作步骤每人取每人取1 16 6支试管，按下表平行操作支试管，按下表平行操作：：12345678标准蛋白质溶液标准蛋白质溶液/mL 00.10.20.30.40.5——待测蛋白质溶液待测蛋白质溶液/mL ——————0.030.05dH2O/mL0.50.40.30.20.100.470.45甲试剂甲试剂/mL 2.52.52.52.52.52.52.52.5混匀，于室温放置混匀，于室温放置10min 乙试剂乙试剂/mL 0.250.250.250.250.250.250.250.25迅速混匀，室温放置迅速混匀，室温放置30min后，以后，以dH2O为空白，在为空白，在640nm处比色处比色 A640nm(1) A640nm (2) A640nm 2024/9/13* 标准蛋白质溶液为牛血清清蛋白标准蛋白质溶液为牛血清清蛋白 ( 150µg/mL )。

侍测样品侍测样品x为为POD酶原液，轻轻倒置摇匀后酶原液，轻轻倒置摇匀后用注射器加用注射器加50µL(0.050 mL)，去离子水加，去离子水加0.450 mL 2024/9/132.注意事项：注意事项：* 定量测定要求各种试剂量取准确，正确规范使定量测定要求各种试剂量取准确，正确规范使用移液管用移液管 乙试剂在酸性条件下稳定，而甲试剂在碱性条乙试剂在酸性条件下稳定，而甲试剂在碱性条件下与蛋白质反应，生成碱性的铜件下与蛋白质反应，生成碱性的铜-蛋白质络合蛋白质络合物溶液，所以在加入乙试剂后，应迅速摇匀物溶液，所以在加入乙试剂后，应迅速摇匀(用用振荡器振荡器)，使还原反应发生在磷钼酸，使还原反应发生在磷钼酸-磷钨酸试磷钨酸试剂被破坏之前加一管摇一管，直接取吹下，剂被破坏之前加一管摇一管，直接取吹下，二人可合作，乙试剂比重大，一定要摇起来二人可合作，乙试剂比重大，一定要摇起来 待测样品所取体积应使其浓度在标准曲线范围待测样品所取体积应使其浓度在标准曲线范围内2024/9/13四四. 数据处理数据处理1. 制作标准曲线制作标准曲线以标准蛋白质含量以标准蛋白质含量 ( 15,30,45,60,75µg )作横座标，每管减空白的光吸收值作横座标，每管减空白的光吸收值(A640nm) 作纵座标，过原点作直线。

作纵座标，过原点作直线2024/9/13 2. 计算样品计算样品(POD)蛋白质浓度蛋白质浓度 根据根据7号待测样品管光吸收值从曲线上查出对号待测样品管光吸收值从曲线上查出对应的蛋白质含量代入下式：应的蛋白质含量代入下式： 7号样品对应蛋白质含量号样品对应蛋白质含量 ( µg )×10–3C POD ( mg/mL ) = ———————————— 样品体积样品体积 ( 0.050 mL )2024/9/133. 计算比活力计算比活力 POD比活力（比活力（μmol/min/mg蛋白质）蛋白质） 酶活力单位酶活力单位 = —————————————— 酶活力测定所用酶蛋白量酶活力测定所用酶蛋白量 酶活力单位酶活力单位 ( IU ) = ——————————————— C POD( mg/mL )×(0.020 ~ 0.200)mL 2024/9/13•注意：注意： 用用Folin酚法测出的是酚法测出的是酶原酶原液蛋白质浓度（液蛋白质浓度（mg/mL），），而计算而计算比活力时所用酶蛋白量应是酶原液比活力时所用酶蛋白量应是酶原液蛋白质浓度（蛋白质浓度（mg/mL））×实际测定实际测定时用的该酶体时用的该酶体(0.020~0.200)mL 2024/9/13。