碱性磷酸酶米氏常数的测定ppt课件.ppt

碱性磷酸酶米氏常数的测定碱性磷酸酶米氏常数的测定 浙江中医药大学生命科学学院浙江中医药大学生命科学学院 生物化学教研室生物化学教研室[ [目的与要求目的与要求] ] 经过碱性磷酸酶米氏常数的测定，了解其测定方法及经过碱性磷酸酶米氏常数的测定，了解其测定方法及意义学会运用规范曲线测定酶的活性，加深对酶促反响动学会运用规范曲线测定酶的活性，加深对酶促反响动力学的了解力学的了解 [原理原理] 酶催化底物发生反响时，受多种要素影响，环境的温度、pH和酶的浓度等等，在环境的温度、pH和酶的浓度一定时，酶促反响速度与底物浓度之间的关系表如今反响开场时酶促反响的速度(V)随底物浓度(S)的添加而迅速添加假设继续添加底物浓度，反响速度的添加率将减少当底物浓度添加到某种程度时，反响速度会到达一个极限值，即最大反响速度(Vmax)，如图37所示  底物浓度与酶促反响速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示 V = Vmax[S]/(Km+[S]) 上式中Vmax为最大反响速度，[S]为底物浓度，Km为米氏常数(Michaelis constant)，而其中V那么表示反响的起始速度。

当V= Vmax/2时，Km =[S]所以米氏常数是反响速度等于最大反响速度一半时底物的浓度因此Km的单位以摩尔浓度(mol／L)表示 Km是酶的最重要的特征性常数，测定Km值是研讨酶动力学的一种重要方法，大多数酶的Km值在0.01-100(mmol/L)间  酶促反响的最大速度Vmax实践上不易准确测定，Km值也就不易准确测出林-贝 (1ineweaver - Burk)根据Michaelis-Menten方程，推导出如下方程式，即：(两边取倒数〕 1/V = 〔Km +[S]〕/ Vmax[S] 或1/V = Km/ Vmax·〔1/[S]〕+1/ Vmax (得类似：y=ax+b的直线方程 〕 y = 1/V， a = Km/ Vmax， x = 1/[S] b = 1/ Vmax 此式为直线方程，以不同的底物浓度1/[S]为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成不断线，向纵轴方向延伸，此线与横轴相交的负截距为-1/ Km，由此可以正确求得该酶的Km值，如下图。

 本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图，计算其Km值 可以作为碱性磷酸酶底物的物质很多，底物反响的酶对于不同的底物有不同的Km值本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比根据吸光度的大小可以计算出酶的活性，也可以从规范曲线上查知酚的含量，进而算出酶活性的大小反响式如下： 三、三、[ [试剂与器材与器材] ] 1 1．．0.04mol/L 0.04mol/L 基基质液液 2 2．．0.1mol0.1mol／／L L碳酸碳酸盐缓冲液冲液pH10(37℃) pH10(37℃) 3 3．碱性溶液．碱性溶液 4 4．．0.50.5％％铁氰化化钾 5 5．．0.30.3％％ 4- 4-氨基安替比林氨基安替比林 6 6．酚．酚规范液范液(0.1mg/mL) (0.1mg/mL) 7 7．．37℃37℃恒温水浴恒温水浴锅 8 8．可．可见光分光光度光分光光度计四、四、[ [操作步操作步骤] ] 1 1．酚．酚规范曲范曲线的的绘制制 ：： 酚含量〔酚含量〔μgμg〕：〕： 0 5 10 0 5 10 20 30 40 20 30 40 (2)(2)混匀后室温放置混匀后室温放置1515分分钟，于，于510nm510nm波波优点比色。

点比色 (3)(3)以酚含量以酚含量(μg)(μg)为横坐横坐标，吸光度，吸光度为纵坐坐标，，绘制酚制酚规范曲范曲线 2. 2. 底物底物浓度度对酶促反响速度的影响促反响速度的影响 最最终基基质浓度度单位：位：µmol/ml µmol/ml (2)(2)参与血清后，各管混匀并且立刻参与血清后，各管混匀并且立刻记录时间，将上述，将上述各管置各管置37℃37℃水浴中准确保温水浴中准确保温1515分分钟3)(3)保温保温终了，立刻加碱性溶液了，立刻加碱性溶液1.1mL1.1mL终止反响  (4)各管分别参与0.3％ 4-氨基安替比林1.OmL，0.5％ 铁氰化钾2.0mL，充分混匀，放置10分钟，以6号空白管作对照，于510nm波优点比色测定，根据酚规范曲线计算酶活性 (5)以各管基质浓度的倒数1/[S]为横坐标，以各管吸光度的倒数或者以酶活性单位的倒数1/V作纵坐标，作图求出Km值 [结果与计算] 在37℃保温15分钟，每生成1mg酚为一个酶活性单位，以规范曲线查出释放酚量(μg)即可算出酶活性 100mL血清中酶活性 = 释放的酚量×〔1/0.1〕×100×〔1/1000〕=释放的酚量〔μg〕 〔释放酚量〔μg〕、1/0.1--0.1为实践取血清0.1ml、100为100ml血清、1000为μg变为mg。

〕[ [本卷须知本卷须知] ] 1 1．血清取量要准确．血清取量要准确 2 2．规范曲线必需是一条直线．规范曲线必需是一条直线〔一〕〔一〕   Km   Km值测定的意定的意义1.1.当反响速度为最大速度一半时，当反响速度为最大速度一半时，Vm = 1/2 VmaxVm = 1/2 Vmax，，Km = [S]Km = [S] Km Km是指底物的浓度，含义：是指底物的浓度，含义：KmKm值等于酶促反响速度为值等于酶促反响速度为最大速度一半时的底物浓度最大速度一半时的底物浓度 2. Km 2. Km值可表示酶对底物的亲和力值可表示酶对底物的亲和力 Km Km值愈小，酶与底物的亲和力愈大；表示不需求很值愈小，酶与底物的亲和力愈大；表示不需求很高的高的 底物浓度便可容易地到达最大反响速度底物浓度便可容易地到达最大反响速度 3.Km 3.Km值是酶的特征性常数之一，只与酶的构造、酶所催化的值是酶的特征性常数之一，只与酶的构造、酶所催化的底物和反响环境相关，与酶的浓度无关底物和反响环境相关，与酶的浓度无关。

各种酶的各种酶的KmKm值范围很广大多数酶在值范围很广大多数酶在0.01-100mmol/L0.01-100mmol/L间；对于间；对于同一底物，不同的酶有不同的同一底物，不同的酶有不同的KmKm值；多底物反响的酶对于不值；多底物反响的酶对于不同底物也有不同的同底物也有不同的KmKm值  〔二〕〔二〕酶活性〔活性〔U/L〕〕酶活性活性单位：在特定条件下，位：在特定条件下，酶促反响在促反响在单位位时间内生成一定量的内生成一定量的产物或耗物或耗费一定量的底一定量的底物所需的物所需的酶量酶活性国活性国际单位〔位〔IU〕：按照国〕：按照国际酶学会学会议的的规定，定，1个个酶活力活力单位是指在位是指在25℃℃、丈量的、丈量的最适条件〔指最适最适条件〔指最适pH、温度等〕下，、温度等〕下，1分分钟内能引起内能引起1微摩微摩尔底物底物转化的化的酶量课后复习题 1. 1.写出林贝方程写出林贝方程 2. 2.简要表达碱性磷酸酶简要表达碱性磷酸酶KmKm测定方法测定方法。