第五章 黄连.docx

第五章 黄连不同炮制品中主要生物碱体内分布研究黄连为毛茛科多年生草本植物黄连 CoptischinensisFranch 的根茎［1］,其 活性成分为黄连生物碱石柱黄连(味连)含小檗碱 50%左右,而小檗碱、药根碱、 巴马汀和黄连碱等 4 个生物碱之和占总生物碱的 90%左右［2］有关小檗碱的药 代动力学研究较多［3-4］,其他黄连生物碱的药代动力学研究相对较少［5］中药 成分在动物体内的代谢与作用网络具有/网通虹势规律［6-7］:中药材成分群往往 是同一母核的多种衍生物,药理作用相似;同一母核的有效成分衍生物群在动物 内可以相互抑制、加速及转化,其代谢网络相容相通;动物内存在巨大的与自然界 类似的以 CYP450 酶为主导的代谢酶网络系统,按 CYP450 进化树的关系对中药及 复方成分组群进行代谢和产生药效黄连生物碱的结构类似,均是异喹啉类生物 碱的衍生物这些生物碱之间在动物体内是否存在相互之间的转化黄连为毛茛科植物黄连(Coptis chinensis Franch.)、三角叶黄连(Coptis del to idea C.Y.Chenge t Hsiao)、或云连(Cop tis teeta Wall.) 的干燥根茎。

具有清热燥湿、泻火解毒功效，始载于《神农本草经》，列为上品［1］(⑴魏•吴晋 等述.神农本草经.清•孙星衍，孙冯翼辑.北京：人民卫生出版社，1982.26)也称味连、鸡爪连、 川连，目前主要产地为湖北省利川市、重庆市石柱县其性味苦，寒，归心、脾、 胃、肝、胆、大肠经根茎含多种异喹啉类生物碱，其主要活性成分为小檗碱、 黄连碱、表小檗碱、药根碱、巴马汀、非洲防己碱、 Groenlandicine 等生物碱 有文献报道，总生物碱的含量高达 10%以上，盐酸小檗碱、药根碱、表小檗碱、 巴马汀、黄连碱五种生物碱占据黄连总生物碱含量的98%以上其中以小檗碱含 量最高为50%以上［2］ (: 2 ］钟国跃，黄小平,马开森，等•我国黄连(味连)质量评价研究 ［J］.中国中药杂志,2005,30(7): 5941)现代药理研究表明，黄连具有抗菌、消炎、 止痛、解毒、退热、驱风、健胃、利胆、降血糖、降血脂、降血压、抗肿瘤、扩 张血管，以及治疗腹泻、痢疾等功效，临床主要用于肠胃湿热和痛肿疗毒等症的 治疗目前有关小檗碱的药代动力学及体内分布研究较多［3-4］(［3］吴晓霞，彭娟， 范斌，等1.LC-MS-MS测定黄连解毒汤中3种生物碱在大鼠血清的含量及其药代动力学研究［J］.中国中药杂 志,2009, 34(10): 12761.［ 4 ］赵玉男，邢东明.解热药YL2000中小檗碱在正常和发热大鼠体内的药物动 力学比较［J］.中国药理学通报.2003,19(10): 1170)，其他黄连生物碱的药代动力学及体内 分布研究相对较少［5］ (李亚梅，叶小利，李雪梅，等.助剂对小鼠吸收黄连总生物碱的影响及药代动力学的研究[J].中国中药杂志，2009,34（3）:3441）。

本研究以黄酒为辅料，经炒制、蒸制炮制方法处理后，黄连不同炮制品所含 主要生物碱在体内不同组织脏器的分布情况，力图从体内分布角度揭示“三焦” 理论1・材料1.1动物SD小鼠，体重（18-20 g）,雌雄各半，由南京中医药大学动物中心提 供，合格证号SCXK（渝）2007-00011.2 仪器与试剂（1） 仪器： 液质联用系统：SHIMADZU UFLC XR超快速液相色谱仪（日 本岛津公司，包括LC-20AD型输液单元，STL-20A XR型自动进样器，CTO-20AC 型柱温箱）；AB SCIEX QTRAP 5500 型质谱仪（美国 AB SCIEX 公司），Analyst 1.5 软件；KQ5200DA型数控超声波清洗器；TG16-W微量高速离心机,组织匀浆器2） 试剂：盐酸药根碱（纯度鼻98%,批号960383-96-4;表小檗碱（纯度$98%,批号 MUST-11022503）；黄连碱（纯度$98%，批号 3486-66-6）；盐酸巴 马汀（纯度$98%，批号10605-02-4）；盐酸小檗碱（纯度$98%，批号633-65-8）； 四氢巴马汀（ ）等均购自成都曼思特生物科技有限公司，含量98%以上；其他试剂均为分析纯或色谱纯。

1.3 药材及炮制方法黄连采挖自湖北省恩施州利川市佛宝山官康彬农户五年生黄连，经南京中 医药大学陈建伟教授鉴定为毛茛科植物黄连（ CoptischinensisFranch. ），习称 “味连”、“鸡爪连”黄连生品：黄连药材经产地加工，火燎去须根和泥沙，干燥，撞去残留须 根，强水抢洗，切片，干燥后即得南京海源中药饮片公司，批号 ）黄连酒炒品：取上述生黄连生饮片适量，加黄酒拌匀，闷透，置铁锅内， 用文火慢慢炒制，炒至色泽加深，略带酒香气时取出，干燥后即得黄连每 1kg， 用黄酒 kg （南京海源中药饮片公司，生产批号： ）黄连酒蒸品：取上述生黄连饮片，加黄酒拌匀，闷透，置蒸制容器内，用 黄酒蒸汽加热，至色泽变深，带有酒香气时取出，干燥后即得黄连每1kg,用 黄酒 kg南京海源中药饮片公司，生产批号： ）1.4 样品液制备黄连生品供试液的制备：取生黄连饮片适量，煎煮提取二次，第一次加水10倍煎煮提取1h，过滤，滤渣加水8倍，煎煮提取1h，过滤，合并两次滤液， 浓缩至0.9g生药/ml, 4°C储存备用黄连酒炒品供试液的制备：取酒炒黄连饮片适量，煎煮提取二次，第一次 加水10倍煎煮提取lh,过滤，滤渣加水8倍，煎煮提取lh,过滤，合并两次滤 液，浓缩至0.9g生药/ml，4°C储存备用。

黄连酒蒸品供试液的制备：取酒蒸黄连饮片适量，煎煮提取二次，第一次 加水10倍煎煮提取lh，过滤，滤渣加水8倍，煎煮提取lh，过滤，合并两次滤 液，浓缩至0.9g生药/ml，4°C储存备用2 方法2.l 色谱条件色谱条件 ACQUITY UPLC T3 C18 色谱柱（2. 1mm X 100 mm, 1. 8 p m, Waters 公 司）;柱温40 °C;流动相0. 2%甲酸水（A） -0. 2%甲酸乙腈（B）,等度洗脱2min,流速0. 4 mL • min—1 ;进样量 2 p L质谱条件：采用AB 5500 UFLC QTRAP MS, ESI源，检测方式为选择离子监测模式（MRM）, 正离子检测方式，喷雾电压5500 eV,离子源温度（TEM）为550 °C,气帘气（CUR N2）为 35 Pa，雾化气（GS1 N2）为50 Pa,辅助气（GS1 N2）为50 Pa,去簇电压（DP）为70eV;检 测电压1.6KVQ1 怖日55 (Dal338.300Q3 Mass (Da)279.200Cwellfm&ecl100.00ParamDPCECXPStart31.0037.0022.00Stop31JXI37.0022.00IDQ I Mass (Da|Q3 Mass (Da)ParamStartStopID9S.1M100 00 'DP36.00施00CE69.00曲.1X1CXP10.0010.00Q1甬弱Q3 (Da)匚T*l|[rn黑匸〕F'gr^m知StopID320 100100 00DP191 OQ191 00CE“ QO41 00CXP26 002&JXQI 隔55 (Dal□3 Mass [Da?CwelllmseclParamStartStopID352.100336.00010000DP151.00151 00CE39.0039.00CXP26.002&MQ I (Da|□3 Mats (Da)D^mmsec]ParamStanStepID^5.70032Q.1OQ100 00DP310031.00CE的OD29 JX)CXP18.0018W□1 Mass (Ds]Q3 Mass (Da)Cwsllfmsec]PgramStartStopID319.950292000100 00DP86 00S&.fKCE39.0039 00CXP14.001400Q1 Mass (Dai□a Mass ID戲DiWll|m50C)ParamStartStopID^38.0002^1100100.00DP146.00他00CE37.0037.00CXP20.0020.002.2 溶液配制（1）内标物溶液配制：称取四氢巴马汀对照品适量，用甲醇配制成浓度为 200ng/mL。

2）对照品溶液配制：非洲防己碱对照品溶液配制：称取非洲防己碱约2mg,精密称定，置10mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，使其浓度为202》g/mL黄连碱对照品溶液配制：称取黄连碱约2mg，精密称定，置10mL容量瓶中， 用甲醇稀释至刻度，使其浓度为 182》 g/mL盐酸药根碱对照品溶液配制：称取盐酸药根碱约2mg，精密称定，置50mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，使其浓度为 42》 g/mL盐酸巴马汀对照品溶液配制：称取盐酸巴马汀约2mg，精密称定，置10mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，使其浓度为 222》 g/mL盐酸小檗碱对照品溶液配制：称取盐酸小檗碱约2mg，精密称定，置10mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，使其浓度为 235》 g/mL表小檗碱对照品溶液配制：称取盐表小檗碱约2mg，精密称定，置10mL容 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，使其浓度为 211》 g/mL木兰花碱对照品溶液配制：称取木兰花碱约2mg，精密称定，置10mL容量 瓶中，用甲醇稀释至刻度，使其浓度为 226》 g/mL3）混合对照品溶液配制：从上述对照品溶液中，分别精密移取非洲防己 碱对照品溶液800》L、黄连碱对照品溶液800》L、盐酸药根碱对照品溶液240 》L、盐酸巴马汀对照品溶液800》L、盐酸小檗碱对照品溶液800》L、表小檗碱 对照品溶液800》L、木兰花碱对照品溶液800》L置100mL容量瓶中，甲醇定容 至刻度。

精密移取上述混合对照品溶液3mL，置50mL容量瓶，用甲醇稀释至刻 度，使其浓度分别为非洲防己碱96.96ng/mL、黄连碱87.36ng/mL、盐酸药根碱 60.48 ng/mL、盐酸巴马汀106.56 ng/mL、盐酸小檗碱112.8 ng/mL、表小檗碱 101.28 ng/mL、木兰花碱 108.48 ng/mL2.3组织样品预处理：称取组织样品（心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、大肠） 各0.1g，精密称定，置50mL具塞离心塑料试管中，精密移入甲醇与盐酸混合液 （100:1）20mL,加入内标溶液5mL，精密称定，进行组织匀浆，超声提取30min， 补足重量，以3000r/min转速离心5min，取上清液1 mL，以10000r/min转速离 心5min，微孔滤膜过滤取上清液进行HPLC-MS/MS分析2.4 动物分组SD小鼠，平衡喂养3d后，随机分成空白对照I组、生品I。