外源基因在大肠杆菌中表达简略实验步骤.doc

目的基因在大肠杆菌中的诱导表达目的基因在大肠杆菌中的诱导表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测[主要试剂主要试剂]1、LB 培养基2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG 溶于100ml ddH2O 中,0.22μm 滤膜抽滤，-20℃保存[操作步骤操作步骤]1、通过 PCR 方法获得目的基因：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点，本实验中为 BamHⅠ和 HiindⅢ） ，PCR 循环获得所需基因片段PCR 反应体系为：模板（含 R 基因的重组质粒）1μl上游引物 PR11μl下游引物1μldNTP（2.5mmol/L）5μl10×PCR buffer（含 Mg2+）10μlTaq 酶1μlddH2O 补至100μlPCR 反应条件为：94℃变性 3min；94℃变性 3min、52℃复性40sec、72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸8min。

2、构建重组表达载体（1）载体酶切：将表达质粒 pRSETA 用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用凝胶回收 Kit 或冻融法回收载体大片段2）R 基因 PCR 产物双酶切后回收，在 T4 DNA 连接酶作用下连接入载体连接反应体系为：pRSETA1μlR 基因片段3μlT4 DNA 连接酶（5U/μl）1μl5×buffer2μlddH2O 补至10μl3、获得含重组表达质粒的表达菌种（1）将连接产物转化大肠杆菌 DH5α，根据重组载体的标志（抗 Amp）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点3）以此重组质粒 DNA 转化表达宿主菌 BL21（DE3）的感受态细胞4、诱导表达1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含 Amp50μg/ml）中37℃过夜培养2、按1∶100比例稀释过夜菌，一般将1ml 菌加入到含100mlLB 培养基的300ml培养瓶中, 37℃震荡培养至 OD600≌0.5-0.8（最好0.6，大约需3hr） 。

3、取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入 IPTG 诱导剂至终浓度1mM 作为实验组，两组继续于37℃、200rpm 震荡培养3hr4、分别取菌体1ml,，离心12000g×30s 收获沉淀，用100μl 1%SDS 重悬，混匀，70℃10min5、离心12000g×1min，取上清作为样品,可做 SDS-PAGE 等分析6 5500rpm 15min 收集细胞7溶菌酶破碎细胞 制备过柱上清8 过柱纯化带组氨酸标签蛋白。