川芎嗪对大鼠肾脏缺血-再灌注损伤保护作用及抗细胞凋亡作用【医学论文】.doc

医学论文-川芎嗪对大鼠肾脏缺血/再灌注损伤保护作用及抗细胞凋亡作用作者：王汉民，谭华，赵洪雯，张鹏，黄朝晖，何丽洁，陈光磊，吴雄飞 【摘要】 目的: 探讨川芎嗪对缺血/再灌注（I/R）损伤大鼠肾功能、肾脏组织形态学、细胞凋亡及相关基因表达的影响. 方法: 将大鼠随机分为假手术（S）组、I/R 组、再灌注后给予川芎嗪（TMPpost ）组、再灌注前给予川芎嗪（TMPpre ）组，各组分别采用化学法测定血尿素氮和肌酐，光镜和电镜观察肾组织形态学变化，原位末端标记法检测肾脏细胞凋亡指数，免疫组化和免疫印迹法检测肾脏 Bcl2 和 Bax 蛋白的表达. 结果: TMPpre 组较 I/R 组血尿素氮和肌肝显着降低，肾小管损伤评分减轻，分别为［（21.8±5.2）vs (31.1±4.4) mmol/L，P＜0.01) ］，［（196±55）vs （295±64）μmol/L，P＜0.01）］，［(372±46) vs （563±62），P＜0.01) ］；肾小管上皮细胞损伤及超微结构改变明显减轻，肾组织凋亡细胞数明显减少［（13.6±2.9） vs （28.8±4.6），P<0.01）］；Bcl2 蛋白表达明显增强［（1.15±0.12） vs （0.88±0.12），P<0.05）］，Bax 表达明显减弱［（0.87±0.11） vs （1.15±0.09），P<0.05）］. 结论: 川芎嗪可明显减轻 I/R 肾损伤，其保护作用机制与 Bcl2 蛋白表达增强和 Bax 蛋白表达减弱介导的肾脏细胞凋亡有关. 【关键词】 川芎嗪；肾脏；再灌注损伤；细胞凋亡；保护【Abstract】AIM: To explore Ligustrazine (Tetramethylpyrazine, TMP) on the effect of in rats wit rat renal functions, renal tissue morphology, cell apoptosis and expressions of related genes in rats with. METHODS: Forty Wistar rats of either sex were randomly divided into 4 groups, which were sham operation(n=10), I/R model(n=10), TMPpost (n=10, intraperitoneal TMP 32 mg/kg per 6 h after reperfusion for 30 min) and TMPpre (n=10, intraperitoneal TMP 32 mg/kg at 45 min, 8, 16, 24 h before ischemia) groups. Blood urea nitrogen and creatinine were detected by chemical method. Renal cell apoptotic index was examined by means of terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labeling(TUNEL). The expressions of Bcl2 and Bax in kidney was immunohistochemically evaluated and quantified by Western Blot analysis. The kidney histology were observed by light and electron microscope. RESULTS: Compared with those in the TMPpre group, the blood urea nitrogen［（21.8±5.2）vs (31.1±4.4) mmol/L，P＜0.01］, the creatinine ［（196±55） vs （295±64）μmol/L，P＜0.01）］ and the score of injury in renal tubules ［(372±46) vs （563±62），P＜0.01) ］ were decreased significantly in I/R group. The changes of injury and ultrastructure in tubular epithelial cells were significantly attenuated in TMPpre group. By Tetramethylpyrazine pretreatment, the apoptotic index (13.6±2.9 vs 28.8±4.6, P<0.01) and the expression of Bax (0.87±0.11 vs 1.14±0.09, P<0.05) were decreased significantly, and the expression of Bcl2(1.15 ±0.12 vs 0.88±0.12, P<0.05) was increased significantly as compared with that in I/R group. CONCLUSION: Tetramethylpyrazine can attenuate kidney I/R injury, and protective mechanism may be partly through inhibition of cell apoptosis by regulating the expressions of apoptosisrelated genes Bcl2 and Bax.【Keywords】 tetramethylpyrazine; kidney; reperfusion injury; apoptosis; protection0 引言川芎嗪是从伞形科植物川芎根茎中分离提纯的一种生物碱单体，其基本化学结构为四甲基吡嗪，具有扩张血管、改善微循环等作用，临床上广泛用于心脑血管疾病的治疗，并取得较好疗效. 川芎嗪对肾脏缺血/再灌注（I/R）损伤的保护作用已被大量研究证实［1-2］，但这种保护作用的机制尚不完全清楚，我们通过观察川芎嗪对 I/R 损伤大鼠肾功能、肾组织形态学、细胞凋亡及Bcl2 和 Bax 蛋白表达的影响，进一步探讨川芎嗪对肾 I/R 损伤的保护作用机制.1 材料和方法1.1 材料 健康成年 Wistar 大鼠 40 只，雌雄不拘，体质量 200～240 g（第四军医大学实验动物中心），动物许可证号 SCXK（军 2002005 ），标准饲料，自由进食水，普通光照. 兔抗大鼠 Bcl2 和 Bax mAb、兔抗βactin （Santa Cruz 公司）；免疫组化试剂盒、DAB 显色试剂盒（武汉博士德生物工程公司）；原位细胞凋亡(TUNEL)试剂盒（美国 Roche 公司）；细胞裂解液（美国 BDBiosciences 公司）；BCA 试剂盒（美国 Pierce 公司）；SDS 聚丙烯酰胺凝胶（美国 Invitrogen 公司）；硝酸纤维素膜（美国 Life Science公司）；血尿素氮（BUN）、血肌酐（Cr）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；川芎嗪注射液（无锡第七制药厂，批号 02081911）. JEM100SX 型透射电镜（日本 JEOL 公司），凝胶图像分析系统（美国 Kodak 公司）等.1.2 方法1.2.1 分组及动物模型制备 将 40 只大鼠随机分为 4 组，每组 10 只. S组：假手术对照组；I/R 组：缺血再灌注模型组；TMPpost 组：在 I/R 模型的基础上，再灌注 30 min 后腹腔注射川芎嗪，32 mg/kg，每 6 h 1 次，共 4 次；TMPpre 组：在制备 I/R 模型前 24，16，8 h，45 min 腹腔注射川芎嗪, 32 mg/kg，I/R 造模后不再注射川芎嗪. I/R 模型制作参照 Basile 等方法进行［3］，用 30 g/L 戊巴比妥钠 30～50 mg/kg 腹腔注射麻醉，经腹正中切口暴露双侧肾脏，游离肾蒂，用无损伤动脉夹同时钳夹双侧肾动脉，阻断 45 min 后松开动脉夹. 假手术组仅游离双侧肾脏，暴露 60 min 后再关闭腹腔切口. 24 h后再用戊巴比妥钠麻醉大鼠，采血并摘取左肾，血标本以 4000 r/min 离心 10 min，分离血清，置-20℃保存用于测定 BUN 和 Cr. 取部分肾组织分别用 40 g/L甲醛和 30 mL/L 戊二醛固定以制备石蜡切片和电镜切片，另取部分肾组织迅速置入液氮中，然后于-80℃冰箱保存，用于提取蛋白.1.2.2 肾功能测定 测定血 BUN 采用二乙酰一肟显色法，测定血 Cr 采用碱性苦味酸比色法，应用 721 分光光度计测定.1.2.3 肾组织学观察 石蜡切片行 HE 和 PAS 染色，光镜下观察肾组织形态学改变，参照 Paller 等方法进行评分［4］，每只大鼠肾组织随机选择 10 个视野（×200），每个视野下随机选择 10 处肾小管，共按 100 个肾小管计分，分数越高表示肾小管损伤程度越严重. 电镜切片行醋酸铀和枸橼酸铅染色，在透射电镜下观察肾组织的超微结构变化.1.2.4 肾组织细胞凋亡检测 采用 TUNEL 检测细胞凋亡指数，参照 TUNEL试剂盒说明书进行，显色采用 DAB 试剂盒进行. 光镜观察凋亡细胞，胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞. 于阳性表达分布区域、光镜 200 倍下随机选择 5 个无重叠视野，计数阳性细胞，以凋亡阳性细胞数占总细胞数的百分比作为细胞凋亡指数（AI）.1.2.5 肾组织 Bcl2 ，Bax 免疫组化染色 采用兔抗鼠 Bcl2 和 Bax mAb，参照抗 Bcl2 和 Bax 试剂盒进行，显色采用 DAB 试剂盒进行. 光镜观察胞质中有棕色颗粒者为阳性细胞.1.2.6 Western Blot 检测肾组织 Bcl2 ，Bax 蛋白表达 称取肾组织，按常规加入细胞裂解液，进行组织匀浆，取上清液用 BCA 试剂盒进行蛋白定量，经 100℃ 10 min 变性后，用 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离. 电泳后电转移至硝酸纤维素膜上，用丽春红染液染膜，脱脂奶粉于室温封闭，与 Bcl2 ，Bax抗体 37℃孵育 4℃过夜. 摇洗并加入二抗室温孵育，再次洗涤，滴加显色液至硝酸纤维素膜上，X 光胶片感光，用 Kodak 凝胶图像分析系统进行灰度扫描. 统计学处理：计量资料用 x±s 表示，多组样本均数之间比较采用单因素方差分析，各组间的两两比较采用多个均数间的多重比较（Dunnettt 检验），应用 SPSS13.0 统计软件，P＜0.05 为差异有统计学意义.2 结果2.1 肾功能的变化 各组血 BUN 和 Cr 变化见表 1.表 1 各组血 BUN 和 Cr、凋亡指数及肾小管损伤程度评分的比较（略）aP＜0.05，bP＜0.01vs I/R 组. S：对照组；I/R：缺血/再灌注组；TMPpost ：I/R 造模后给予川芎嗪；TMPpre ：I/R 造模前给予川芎嗪. 2.2 肾组织形态学改变 各组肾小管损伤程度评分结果见表 1. S 组光镜观察肾组织无明显病变，电镜亦未见明显异常. I/R 组光镜可见皮髓间有明显淤血带，肾小管上皮细胞刷状缘消失，出现空泡、滴状变性，严重者细胞脱落、坏死、基底膜裸露. TMPpost 组光镜改变较 I/R 组有所减轻，而 TMP。