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EAAL 方法预防肝癌复发转移的研究 发表者：毛一雷( 访问人次：547) 研究摘要：肝癌手术后复发转移的控制，是肝癌治疗面临的最主要挑战细胞免疫治疗方法 EAAL 在大规模随机临床试验中被证明可以降低肝癌术后复发率 18%，使复发的危险率减少 41％在本研究中，我们将采用不同的治疗方案，对 EAAL 配合手术、介入化疗和局部栓塞等常规肝癌治疗方法对复发和转移及病人生存期的影响进行系统的临床研究在此基础上，我们将进一步研究 EAAL 方法作用的可能机制，及肝癌特异性淋巴细胞的治疗可行性名词缩写：EAAL: expanded activated autologous lymphocytes, 扩增活化的自体淋巴细胞CIK Cells: cytokine induced killer cells, 细胞因子诱导的杀伤细胞TIL: tumor infiltrating lymphocytes, 肿瘤浸润淋巴细胞研究目的：1. 在大规模随机临床试验的基础上，试验 EAAL 方法作为免疫辅助治疗，对手术和其它常规治疗后病人复发和转移的抑制作用；2. 通过设计不同的 EAAL 使用疗程和使用频率，试验该方法延长病人生存期的效果；3. 在上述基础上，研究 EAAL 方法可能的作用机制；4. 通过引入肿瘤特异性淋巴细胞的方法，研究更有效的肝癌细胞免疫治疗方法。

研究背景：大多数肝细胞肝癌，特别是伴发肝硬化和其它一些症状的情况下，预后往往都很差外科手术，包括肿瘤切除术或是肝移植，往往是肝癌治疗的唯一手段化疗和肿瘤栓塞术只能缓解症状，对存活率和存活时间没有显著改善[1]因此，寻找肝癌手术后预防转移和复发的手段，成为肝癌治疗的重要研究方向尽管大多数肝癌病人的预后不好，但越来越多的证据表明，免疫应答至少在部分肝癌病人中，对疾病的进展乃至病人的存活至关重要1. T 淋巴细胞:（1） CD8+ T 细胞对肝癌细胞具有特异性识别杀伤作用：较早的研究表明，与大量无 T 淋巴细胞的样本相比，有 T 淋巴细胞浸润的小肝癌的复发率低、5 年生存率高而且占优势的浸润淋巴细胞为 CD8+的 T 淋巴细胞，而非 CD4+的 T淋巴细胞[2]随后，在肝癌组织中发现了特异性识别多种肿瘤相关抗原[3]、肿瘤特异性共享抗原[4]、自体抗原（ AFP[5]和 SART-1[6]）、病毒表位[7 ，8]的 T 细胞CD8+ T 细胞的浸润与肝癌细胞的凋亡呈正相关[Eur J Surg Oncol. 2004 Feb;30(1):53-7. CD8+ lymphocyte infiltration and apoptosis in hepatocellular carcinoma.Ikeguchi M, Oi K, Hirooka Y, Kaibara N.]我们自己的工作证明，肝癌组织浸润的 CD8+ T 细胞，在体外经过活化后，具有杀伤自身肝癌细胞的功能（未发表数据）。

2） CD8+ T 细胞可特异性识别杀伤具有干细胞特征的肿瘤细胞肿瘤干细胞被发现普遍存在于包括肝癌[ ]在内的多种恶性肿瘤组织中，并被认为是肿瘤常规治疗后复发和转移的直接原因[Cancer Cell Int. 2007; 7: 9. Role of stem cells in cancer therapy and cancer stem cells: a review Jayesh Sagar, Boussad Chaib, Kevin Sales, Marc Winslet, and Alexander Seifalian]而另一方面，肿瘤干细胞同样表达肿瘤特异性抗原，并可作为免疫治疗的靶点，如前列腺癌细胞表达的前列腺干细胞抗原 PSCA[ ]最新的研究表明，多发性骨髓瘤（MM）的癌前病变 MGUS 常常表达胚胎干细胞参与自我更新的关键分子 SOX2而识别该分子特异性 T 细胞的存在提示癌前病变的良好预后我们最近建立的一株干细胞样肝癌细胞系中，发现该株细胞表达大量肿瘤特异性共享抗原，同时可被来源于同一病人自身的 CD8+ T 细胞特异性杀伤这提示我们通过利用免疫治疗杀伤肿瘤干细胞，可能达到控制肿瘤复发和转移的目的。

3） 辅助性 CD4+ T 细胞对移植后肝癌的复发有抑制作用有文献表明，肝癌患者进行肝移植后，肝癌复发的危险率与 CD4：CD8 的比例呈正相关，但此种 CD4+ T 细胞为辅助性 T 细胞，而不是表达 CD25 分子的调节性 T 细胞（regulatory T cells）[9]4） CD4+CD25+调节性 T 细胞可通过抑制 CD8+ T 细胞的作用促进肝癌细胞生长存在于肿瘤边缘位置及肿瘤浸润性调节性 CD4+CD25+T 细胞具有抑制肿瘤特异性 CD8+ T 细胞增殖和活化的作用，成为肝癌细胞不受控制生长的原因之一[9，Hepatology. 2005 Apr;41(4):722-30. Compromised lymphocytes infiltrate hepatocellular carcinoma: the role of T-regulatory cells.Unitt E, Rushbrook SM, Marshall A, Davies S, Gibbs P, Morris LS, Coleman N, Alexander GJ.]此外，在肝癌病人的外周血中，其 CD4+CD25+调节性 T 细胞也明显增加，并于肿瘤局部 CD4+CD25+调节性 T 细胞的浸润呈正相关。

这些调节性 T 细胞在体外与非调节性 T 细胞共同培养时，抑制后者的增殖和细胞因子的分泌[Cancer Res. 2005 Mar 15;65(6):2457-64.Increased populations of regulatory T cells in peripheral blood of patients with hepatocellular carcinoma.Ormandy LA, Hillemann T, Wedemeyer H, Manns MP, Greten TF, Korangy F.]2. 细胞因子：细胞因子是调节机体天然免疫和获得性免疫的关键因子细胞因子环境的平衡对获得保护性免疫（如抗病毒，抗肿瘤，抗细菌免疫）及避免病理性免疫（如自身免疫病）至关重要一般来讲，Th1 类细胞因子有利于抗肿瘤免疫，而 Th2 类细胞因子可能有抑制肿瘤免疫的作用Budhu A 等人最近报道，肝癌的局部转移与局部组织的细胞因子为环境直接相关相比于不利于肝内静脉转移的微环境（MAM），趋于肝内静脉转移的微环境中的细胞因子标签出人意料地高表达 Th2 类细胞因子 IL-4, IL-5, IL-8 和 IL-10，而明显低表达 Th1 类细胞因子，包括 IL-1A, IL-1B, IL-2, IFN-g 和 TNF。

在利用细胞因子进行的肿瘤治疗试验中，有证据表明，在作为细胞因子配合疫苗使用时，Th1 类细胞因子，包括 IL-2，-7，-12，-18，IFN-g ，TNF-a 及部分 Th2 类细胞因子，包括 IL-4，-6，可诱导抗肿瘤抗原特异性的免疫应答在直接使用细胞因子进行恶性肿瘤的治疗中，IL-2 和 IFN-a，-g 应用得最为广泛而在评价抗肿瘤免疫中，T 细胞在识别肿瘤细胞后分泌 IFN-g 的量成为评价抗肿瘤免疫应答的最重要指标之一针对肝癌免疫应答的上述特性，适当的免疫治疗方法有可能通过杀伤肿瘤细胞，包括肿瘤干细胞的方式，达到控制肝癌复发和转移的目的这需要解决两方面的问题（1）有识别肝癌细胞的特异性杀伤性 T 细胞；（2）能够改善患者体内免疫环境和免疫微环境，使控制和杀伤肿瘤细胞的免疫细胞能够发挥功能这包括降低 CD4+CD25+调节性 T 细胞的数量，并使 Th1/Th2 细胞因子水平向 Th1 平衡为此，我们拟采用细胞过继免疫治疗 ---扩增活化的自体淋巴细胞（Expanded Autologou Activated Lymphocytes，EAAL)的方法，探索免疫治疗对肝癌复发和转移的预防性效果和对病人生存率、生存期的影响。

肿瘤免疫治疗的主要手段之一，细胞过继免疫治疗，是通过离体扩增病人自身特异性或非特异性淋巴细胞、扩增并回输的过程，来满足上述条件，达到杀伤和/或控制肿瘤细胞的目的这种方法建立于 T 细胞活化分子白细胞介素 2 (IL-2)的发现，包括肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor Infiltrating Lymphocytes，TIL ）方法，LAK（Lymphokine-induced Killer）细胞、CIK （Cytokine-induced Killer）细胞和 EAAL这些方法最主要的不同在于培养前所使用的细胞、培养后所获得的细胞种类不同、培养效率和临床效果不同（表 1）表 1. 不同细胞过继免疫治疗方法的比较细胞免疫治疗名称TIL LAK CIK EAAL起始细胞类型/数量肿瘤浸润淋巴细胞 PBMC，3000-5000ML* PBMC，3000-5000ML* PBMC，20-100ML产出细胞主要类型CD8+ T 细胞 NK 细胞CD3+CD56+ T 细胞（〉50%）CD8+ T 细胞：63.0±24.6%CD4+CD25+ 调节性 T 细胞无相关报道 无相关报道无相关文字报道，口头报告数据：20-50%1.7±1.1%扩增倍数 无相关报道 无相关报道 1-10 倍 100-1000 倍以上产出细胞特异性 肿瘤特异 非特异 非特异 ND临床试验有效性晚期恶性黑色素瘤消退肿瘤作用可达 70%[ ]血液肿瘤 血液肿瘤降低 41% 肝癌术后复发危险率[ ]副作用 白化病（自身免疫病） 无相关报道 无相关报道主要为自限性低热，未见 II 级以上副作用PBMC：外周血单个核细胞 ND：未检测 *使用单个核细胞采集机分离病人相当于此体积的 PBMC。

二十世纪八十年代，Steven Rosenberg 等开始在体内或体外利用 IL-2 刺激机体的 T 淋巴细胞，治疗转移的恶性黑色素瘤（恶黑）和肾癌在早期的研究中，大剂量 IL-2 直接给予病人在对 567 名恶黑患者的临床试验研究中，21％的病人有临床效果 12然而，大剂量IL-2 的治疗同时带来了严重的副作用，包括肾衰、严重的口炎和全身反应等2002 年，Rosenberg 等报道了一种新的细胞过继回输方法，进行肿瘤的免疫治疗 13他们在体外筛选出具有病人自身恶黑细胞特异性杀伤作用的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs ），大量扩增后回输给自体病人在这种方法中，经过体外 IL-2 和抗 CD3 抗体的联合作用，数量高达 1011 的、肿瘤细胞高度特异的 TILs 被回输至病人体内，这些细胞以 CD3+CD8+CD56-的 T 细胞的为主在接受治疗的 13 例病人中， 6 例病人完全缓解， 4 例病人部分缓解这 10 例病人均发生明显的肿瘤缩小和/或消失这个报道，重新燃起了免疫学家和临床医生对细胞过继治疗肿瘤的热情然而，TIL 过继回输的方法在很大程度上受到肿瘤细胞原代培养的成功率、肿瘤特异性浸润细胞的可获得性、体外扩增能力、体外培养后功能的可维持性的限制。

因此，这个方法长期以来难以在临床实施推广最近，在传统的抗 CD3 抗体和 IL-2 体外扩增活化淋巴细胞（细胞因子诱导的杀伤细胞，CIK 细胞）方法的基础上，日本国立癌症研究院关根晖彬（Teruaki Sekine）博士开发了一种新的肿瘤免疫治疗的方法---扩增活化的自体淋巴细胞（Expanded Autologou Activated Lymphocytes，EAAL)在这种新的方法中，使用的淋巴细胞来源于病人自身的少量外周血（20-100ml）在约 2 周的短时间内，这些淋巴细胞可以活化扩增达 1000 倍后，再回输于病人体内在一项历经约 1。