HPLC法测定中药钩藤中钩藤碱与异钩藤碱含量.doc

HPLC法测定中药钩藤中钩藤碱与异钩藤碱含量【摘要】目的：建立高效液相色谱法测定中药钩 藤中有效成分钩藤碱和异钩藤碱的含量方法：色谱柱 Lichrospher C18 (4. 0X250 mm, 5 um),流动相：甲醇： 水(含10mmol/L的三乙胺，冰醋酸调节pH值为7. 4〜7. 6) =55： 45,检测波长为254 nm,加入1%盐酸10uL作为改性 剂温度为25 C,测定钩藤碱和异钩藤碱的线性关系方程 结果：钩藤碱与异钩藤碱的回归方程分别为 Y=9. 2X104-0. 281X104, Y=7. 6X 104-0. 375X 104,线性范 围分别为 0. 100〜1.60 ug/mL (r=0. 9999), 0.211 〜1.379 Ug/mL (r=0. 9998),钩藤碱的平均回收率为99.154%,异钩 藤碱的平均回收率为99. 40%o结论：HPLC法测定中药钩藤 中两种成分的含量，方法简单、快速，精密度及稳定性好， 可以用于控制中药材钩藤的品质关键词】钩藤；钩藤碱；异钩藤碱；高效液相色 谱钩藤为茜草科植物钩藤、大叶钩藤、毛钩藤或者无柄果 钩藤的干燥带钩茎枝：1-2] o钩藤为常用的中药，具有清热、 平肝熄风功能，评价钩藤及其制剂质量多以钩藤总生物碱或 者钩藤碱含量作为指标，测定钩藤碱的方式主要有薄层扫描 法和髙效液相色谱法［3-4］。

本文在上述基础上，流动相中 采用三乙胺缓冲液，以同时分离钩藤碱和异钩藤碱的含量， 改进后的方法分离度、精密度好，操作简单，条件容易控制 现将测定方法报告如下1材料与方法1. 1仪器与材料 美国Waters公司生产的高效液相色谱 仪器：Waters717自动进样系统、Waters 486紫外检测系统、 Waters600泵，德国公司生产的色谱柱Lichrospher C18 (4. 0X250 mm, 5 pm)；钩藤碱,异钩藤碱，纯度＞98% (购 于上海融禾医药科技有限公司提供，批号分别为120206, 120124),甲醇为一级色谱纯，由飞世尔科技(Fisher Scient辻ic)公司提供，水为三蒸水，其他试剂均为分析纯 中药材钩藤购买于北京同仁堂药店(批号：20110805. 20110204、 20110428、 20110516. 20110926. 20111012)1.2实验方法1. 2. 1色谱条件的建立 流动相：甲醇(A)-水(B)(含 10 mmol/L的三乙胺，冰醋酸调节pH值为7. 4〜7.6),流速 为1. 0 mL/min,检测波长为254 nm,进样量为10 u L,加入 1.0%盐酸1011L作为改性剂，等度洗脱，洗脱比例为A：B=55： 45,色谱柱为 Lichrospher C18 (4. 0X250 mm, 5 u m),柱 温为室温。

结果见图lo1.2.2对照品溶液的制备 精密称取钩藤碱、异钩藤碱 标准品2. 0 mg,放置于2.0 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容 并稀释成浓度约为1. 0 mg/mL的溶液，作为标准储备溶液， 放置于-20 9的冰箱中保存，备用1.2.3供试品溶液的制备 取同一批号的中药钩藤，粉 碎后过1号筛，精密称取9. 9947 g,置于500 mL锥形瓶中， 加入200 mL的80%的乙醇溶液，混匀后浸泡60 min,超声 处理40 min,过滤，连续2次，合并提取液，55 C水浴中 蒸干，80%甲醇定容至20 mL容量瓶中，放置于-20 "冰箱 中备用2结果2. 1标准曲线的建立分别精密吸取钩藤碱、异钩藤碱 对照品溶液10、20、40、80、160 uL,甲醇定容至2.0 mL 容量瓶中，配制的系列标准品溶液，从低浓度到高浓度依次 进样，每个浓度进样3次，按照1.2.1项下的色谱条件，以 色谱峰峰面积为纵坐标，对应浓度为横坐标，绘制标准曲线 钩藤碱与异钩藤碱的回归方程分别为 Y=9. 2X104X-0. 281X104, Y=7. 6X 104X-0. 375X104,线性 范围分别为 0. 100 〜1.60 ug/mL(r=0. 9999), 0.211 〜1.379 P g/mL (r=0.9998)o2. 2灵敏度考察取同一批号的中药钩藤，粉碎后过1 号筛，精密称定，置于500 mL锥形瓶中，加入200 mL的80% 的乙醇溶液，混匀后浸泡60 min,超声处理40 min,过滤, 连续2次，合并提取液，55 C水浴中蒸干，80%甲醇定容至 20 mL容量瓶中，放置于-20工冰箱中备用。

取空白样品5 个平行试验，，测得基线噪音值同时加入钩藤碱和异钩藤 碱标准溶液于空白样品中，按照1.2项下的色谱条件测定， 依据信噪比S/N>3定位检测限,RSD值分别为2. 68%和2. 87%, 结果表明仪器的灵敏度较高2. 3稳定性试验 精密吸取供试品溶液10 11 L,按照 1.2. 1项下的色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h进样, 测定钩藤碱、异钩藤碱峰面积值其RSD值分别为1.45%、 1.38%,表明钩藤碱、异钩藤碱在24 h内成分稳定2.4精密度考察同一天连续进样5次，标准品的浓度 以10 uL进样量，HPLC测定标准品溶液的峰面积，考察精 密度，钩藤碱与异钩藤碱精密度的RSD值分别为0.098%、 1.073%结果见表1、表22.5重复性试验 取同一批号的钩藤5份，取同一批号 的中药钩藤，粉碎后过1号筛，精密称取9. 9947 g,置于 500 mL锥形瓶中，加入200 mL的80%的乙醇溶液，混匀后 浸泡60 min,超声处理40 min,过滤，连续2次，合并提 取液，55 C水浴中蒸干，80%甲醇定容至20 mL容量瓶中， 放置于-20 冰箱中备用按照1.2项下的色谱条件进行测 定，分别测定钩藤碱和异钩藤碱的含量,RSD值分别为1.03%、 1. 12%,表明上述的测定方法重复性良好。

2.6加样回收率试验 取同一批号钩藤5份，置于烧瓶 中,精密加入浓度为0. 1969 mg/mL的钩藤碱对照品和2. 0157 mg/mL的异钩藤碱对照品1.0 mL,按照供试品溶液的配制方 法制备供试品溶液，按照1. 2项下色谱条件测定样品中钩藤 碱和异钩藤碱的含量结果见表3、表4 3讨论3.1色谱条件的选择 张荣等［5］在对钩藤的研究报道 中，采用甲醇：水（含0. 01mmol/L三乙胺，冰醋酸调pH7. 0） =70： 30作为流动相，钩藤碱与异钩藤碱可以达到良好的分离效 果，且色谱峰峰形较好在本研究过程中，上述色谱条件下 杂质峰较多，分离效果较差，因此将流动相调整为甲醇：水（含10mmol/L三乙胺，冰醋酸调节pH 7. 4〜7. 6） =55： 45, 色谱峰较好，杂质峰少3.2药材提取方法的选择文献中记载，中药钩藤在煎 煮过程中钩藤碱、异钩藤碱成分预热不稳定，因此采用了超 声提取，选择50%、60%、80%浓度的乙醇作为溶剂分别进行 提取，乙醇浓度80%时，成分的提取率较高，文中选择80% 乙醇作为提取剂［6］3.3实验相关问题对照品钩藤碱溶液与异钩藤碱比 较，稳定性稍差，因此，实验过程中对于配制的溶液均放置 于-20 C的冷冻层进行保存［7］。

反复对其稳定性进行测定, 在24 h内钩藤碱与异钩藤碱的稳定性较好，因此以钩藤碱、 异钩藤碱含量评价钩藤药材质量可行[8]总之，高效液相色谱法测定中药钩藤中钩藤碱、异钩藤 碱的含量，方法简单、快速、灵敏度高，稳定性好，对于评 价钩藤药材质量有重要的参考依据参考文献[1] 姜伟，张丽•钩藤的药理作用研究[J].现代中西医结 合杂志，2007, 15 (21)： 3013.[2] 郑嘉宁，王定勇•大叶钩藤生物碱类化学成分研究 [J].中国医药导报，2009, 15 (1)： 80.[3] 刘佳，富志军.钩藤的研究概况[J].海峡药学，2006, 18 (5)： 90-93.[4] 千英峰，魏璐雪，千保中•高效液相色谱法测定钩藤 中钩藤碱含量[J].药物分析杂志，2006, 19 (1)： 56.[5] 张荣，刘睿，刘启德，等•钩藤中钩藤碱、异钩藤碱 的提取与含量测定[J].中药新药与临床药理，2009, 20 (4)： 338-341.[6] 蒋艳芳，徐慧.超高效液相色谱法测定钩藤中的钩藤 碱和异钩藤碱的含量[J]•中华中医药杂志，2011, 26 (9)： 2119-2120.[7] 李雅臣，马雪梅，陈鸿英，等.钩藤总生物碱提取溶 剂的选择探讨[J].天津中医药，2003, 20 (4)： 67.[8] 王晓颖，刘永静，陈丹，等.HPLC法测定不同产地钩 藤中钩藤碱的含量分析［口•中国中医药科技’211 18⑶: 215-216.（收稿日期：2013-10-29）（本文编辑：黄新珍）。