实验酶促反应与时间的关系——初速度时间范围测定.pdf

取原酶液， 用 0.05mol/L pH5.0 柠檬酸盐缓冲液稀释， 使进程曲线中第11 号管吸光度 A405 在 0.6—0.7 之间 .... b． 0.05mol/L 柠檬酸三钠溶液. 按下表配制，并以测得数据为准 ...本文档由无尘大哥上传至豆丁网实验一酶促反应与时间的关系——初速度时间范围测定 [原理]酸性磷酸酯酶（Acid phosphatase E.C.3.1.3.2）广泛分布于动物和植物中，植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺中它对生物体核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢，骨的生成与磷酸的利用，都起着重要的作用酸性磷酸酯酶是酶动力学研究的好材料 它能专一性水解磷酸单酯键 本实验选用绿豆芽作材料，从中提取酸性磷酸酯酶 以人工合成的对-硝基苯磷酸酯(NPP)作底物，水解产生对-硝基酚和磷酸在碱性溶液中，对-硝基酚盐离子于 405nm 处光吸收强烈，而底物没有这种特性利用产物的这种特性， 可以定量地测定产物的生成量， 从而求得酶的活力单位 即测定单位时间内 405nm 处光吸收值的变化，来确定酸性磷酸酯酶的活性酸性磷酸酯酶一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol 产物所需的酶量。

要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间， 酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择 可以通过进程曲线的制作而求出酶的初速度时间范围 本实验进程曲线是在酶反应的最适条件下采用每隔一定时间测产物生成量的方法， 以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成 从进程曲线可知，在曲线起始一段时间内为直线， 其斜率代表初速度随反应时间延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降 要真实反映出酶活力大小， 就应在初速度时间内测定求出酶反应初速度的时间范围是酶动力学性质的一系列研究中的组成部分和必要前提图酶反应进程曲线[试剂和器材] 1、试剂：（1）酸性磷酸酯酶原酶液取萌发好的绿豆芽，剪去根的头部，称取豆芽茎20g，用蒸馏水洗干净，用研钵研碎，加 0.2mol/L 乙酸盐缓冲液 4mL，置冰箱 6 小时以上将上述绿豆芽浸液倒入纱布内压榨，榨出液 3 000r/min 离心 15min，上清液置透析袋对蒸馏水充分透析，间隔换水10 次，透析24h 以上将透析后酶液稀释至最终体积与豆芽茎克数相等，以3 000r/min 离心 30min，所得的上清液即为原酶液，置冰箱待用（2）酸性磷酸酯酶液取原酶液，用 0.05mol/L pH5.0 柠檬酸盐缓冲液稀释，使进程曲线中第11 号管吸光度A405在 0.6—0.7 之间。

3）1.2 mmol/L 对-硝基苯磷酸酯（NPP）精确称取 NPP 0.4454g，加缓冲液定容至 1000 mL4）0.3 mol/L NaOH2、器材：（1）恒温水浴槽（2）可见光分光光度计（3）试管、刻度吸管[方法和步骤]取试管 12 支，按下表编号，0 号为空白各管加入 1.0mL 1.2 mmol/L NPP；另外 2 支试管，各加入稀释好的酶液 7 mL，在酶反应前底物与酶都放入35℃恒温水浴槽中预热 2 分钟然后向 1～11 号管内各加入 1.0 mL 预热的酶液立即摇匀并开始计时按时间间隔为3、5、7、10、12、15、20、25、30、40、50 分钟进行反应待反应进行到上述各相应时间时，加入 3.0 mL 0.3 mol/L NaOH终止反应冷却后以 0 号管作空白，在分光光度计上测定各管 A405值管号试剂对硝基苯磷酸酯（NPP） （mL）稀释酶液（mL）反应时间（min）0.3 mol/L NaOH（mL）12345678910110*1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.03571012152025304050253.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.0 * 0号管加入 1.0mL NPP 后保温 25 分钟，然后加入 3 mL 0.3 mol/L NaOH ，再加入 1.0mL 酶液。

[数据处理]以反应时间为横坐标，A405为纵座标绘制进程曲线，由进程曲线求出酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围实验二 pH 对酶活力的影响——最适pH 的测定[原理]pH 对酶活力的影响极为显著 酶表现其最高活性时所处的pH 即酶的最适 pH， 因为通常各种酶只在一定pH范围内才表现它的活力； 一种酶在不同pH条件下所表现出来的活性不同pH 之所以对酶活性有很大影响，很可能是因为它改变了酶活性部位有关基团的解离状态在最适 pH 时，酶分子上活性基团的解离状态，最适于酶与底物的结合；而高于或低于最适 pH 时，酶活性部位基团解离状态不利于酶与底物的结合，酶活力也相应降低 pH 也可影响底物的解离及反应系统中其它组分的解离 缓冲系统的离子性质和离子强度， 也可能对酶反应产生影响另外，pH 除了对酶活性有很大影响外，对酶的稳定性也有很大影响过高过低的 pH 会改变酶的活性中心的构象，或甚至改变整个酶分子的结构使其变性失活本实验测定 pH 对酸性磷酸酯酶活性的影响并测定最适pH[试剂和器材] 1、试剂（1）酸性磷酸酯酶原酶液（2）酸性磷酸酯酶酶液：原酶液用水稀释 10 倍左右，使 pH-酶活力曲线中第六管 O.D405在 0.6-0.7 之间。

3）2.4mmol/L NPP水溶液精确称取 NPP 0.8908克，用水溶解并定容至 1000 毫升4）0.3mol/L NaOH（5）各 pH 缓冲液a．0.05 mol/L 柠檬酸溶液b．0.05 mol/L 柠檬酸三钠溶液按下表配制，并以测得数据为准0.05 mol/L 柠檬酸（ml）0.05 mol/L 柠檬酸三钠（ml）pH10082715947352311.54.01.0018294153657788.596992.03.03.54.04.55.05.56.06.50[方法和步骤]取 11 支试管自行编号制表，0 号为空白相应加入2.4mmol/L NPP 0.2 mL，不同 pH 缓冲液各 1.8 mL，每管再各加入 35 ℃预保温（另取 2 支试管，各加入稀释好的酶液5-6 mL，都在 35 ℃恒温水浴槽中保温 2 分钟）的酶液 1 mL，即刻摇匀计时， 15 分钟后加入 0.3mol/LNaOH 2.0 mL 终止反应0 号管先加 NaOH 后加酶液冷却后测O.D405[数据处理]以反应 pH 为横坐标，O.D405为纵坐标，绘制 pH-酶活力曲线，求出酸性磷酸单酯酶在本实验条件下的最适 pH。

实验三温度对酶活力的影响——最适温度的测定 [原理]温度对酶的影响具有双重作用 一方面， 温度加速酶反应的速度； 另一方面酶是蛋白质，温度升高会加速酶蛋白的变性因此，在较低温度范围内，酶反应速度随温度升高而增大；超过一定温度后，反应速度下降酶反应速度达到最大值时的温度称酶反应的最适温度 如果保持其它反应条件恒定， 而在一系列变化的温度下测酶活力； 以温度为横坐标，反应速度为纵坐标作图，可得到一条温度-酶活力曲线，从中可求得最适温度各种酶的最适温度是不同的，一般动物组织的各种酶的最适温度在 35～40℃，植物和微生物的各种酶的最适温度范围较大，大约在 32～60℃之间但最适温度不是酶的特征常数，一种酶的最适温度不是一个恒定数值，它与反应条件有关如反应时间延长， 一般最适温度降低因此，对同一种酶来讲，应说明是在什么条件下的最适温度温度是影响酶促反应速度的重要因素之一在温度较低时，绝对温度对Vmax 的影响遵守 Arrnenius 公式程式：log10Vmax －1Ea1() 常数2.3R T式中 Ea——酶促反应的活化能（Jmol ） ；－1－1R——气体常数（8.314Jmol K） ；T——绝对温度（K） ；Vmax——当酶全部被过量底物饱和时所测得的反应速度。

实验时， 测定不同温度下的酶促最大反应速度Vmax， 以 log10Vmax 对绝对温度 T 作图，得一斜率等于-Ea/ 2.3R 的直线，由此可求得活化能Ea[试剂和器材]1、试剂（1）酸性磷酸酯酶原酶液（2）酸性磷酸酯酶酶液：原酶液用0.05mol/L柠檬酸缓冲液稀释25倍左右， 使测定的第五管O.D405， 在0.6~0.7之间3）1.2 mmol/L NPP（用缓冲液配制）（4）0.3 mol/L NaOH2、器材（1）恒温水浴槽（2）可见光分光光度计（3）试管（4）刻度吸管[方法和步骤]取 8 支试管，自行编号制表，0 号为空白各管加入 1.2 mmol/L NPP 1.0mL，另取 8 支试管加入酶液 2 mL酶与底物对应在 10℃，20℃，30℃，35℃，40℃，50℃，60℃，70℃恒温水浴槽保温 2min酶液预热时间不要超过2min，否则酶易失活， 特别是在温度较高时各管加入酶液 1.0 mL，精确反应 15min 后，加入 0.3 mol/L NaOH 3.0mL 终止反应0 号管反应温度为 50℃， 先加入 0.3 mol/L NaOH 3.0mL 后加酶 冷却后以 0 号管为空白， 测定 O.D405。

[数据处理]1、以反应温度为横坐标，A680(代表反应速度)为纵坐标，绘制温度～酶活力曲线，求出酸性磷酸酯酶在本实验条件下的最适温度2、以反应绝对温度的倒数（1/T）为横坐标，log10A405为纵坐标作图，求出直线部分的斜率，计算酶促反应的活化能实验四米氏常数（Km）和最大反应速度（Vm）的测定[原理]在温度、pH 及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应的速度有很大的影响在底物浓度很低时，酶促反应的速度（v）随底物浓度的增加而迅速增加；随着底物浓度的继续增加，反应速度的增加开始减慢； 当底物浓度增加到某种程度时， 反应速度达到一个极限值（Vmax） Vmax反应速度V底物浓度[S]图底物浓度对反应速度的影响底物浓度与反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示：式中 v——反应速度；Km——米氏常数；Vmax——酶反应最大速度；[S] ——底物浓度从米氏方程式可见：米氏常数Km 等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，米氏常数的单位就是浓度单位(mol/L 或 mmol/L)在酶学分析中，Km 是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质Km 与底物浓度、酶浓度无关，与 pH、温度、离子强度等因素有关。

对于每一个酶促反应，在一定条件下都有其特定的Km 值，因此可用于鉴别酶测定 Km、Vmax，一般用作图法求得作图法有很多，最常用的是Linewaver-Burk 作图法，该法是根据米氏方程的倒数形式，以1/v 对 1/[S]作图，可得到一条直线(见图)直线在横轴上的截距为 -1/Km，纵截距为 1/Vmax，可求出 Km 与 Vmaxv Vmax[S]Km[S]1Km11vVmax[S]Vmax图双倒数作图法抑制剂影响酶促反应的因素之一， 根据抑制剂与酶结合的特点可分为不可逆抑制和可逆抑制二种类型，其中可逆抑制有可分为三种类型： 竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制1）竞争性抑制类型：酶不能同时与底物和抑制剂结合 动力学特征为： 表观米氏常数 Km'增加， Vm'不变下式中 Ki 为抑制剂常数，[I]为抑制剂浓度） v Vm[S][I]Km(1) [S]Ki[I])Ki'Km Km(1（2）非竞争性抑制类型：抑制剂、底物能同时与酶结合，但此复合物不能进一步分解为产物， Km'不变，Vm'下降v Vm[S][I](1)(Km[S])KiVm'V[I]1Ki（3）反竞争性抑制类型：抑制剂必须在酶和底物结合后方能与酶形成复合物，但此物不能分解为产物。

Km'、Vm' 都发生变化v Vm[S][I]Km (1)[S]Ki'VmV[I]1Ki'Km Km(1[I])Ki对于有抑制剂存在的酶促反应，也可采用1/v～1/[S]作图法，求出Km'、Ki、 Vm'，并利用各种可逆抑制类型的动力学特点判断抑制类型图各抑制剂双倒数图[试剂和器材]1、试剂[试剂和器材]1、试剂（1）酸性磷酸酯酶原酶液（2）0.05mol/L 柠檬酸缓冲液（pH5.0）（3）酸性磷酸酯酶酶液：原酶液用0.05mol/L柠檬酸缓冲液稀释25倍左右， 使测定的第五管O.D405， 在0.6~0.7之间4）1.2 mmol/L NPP（用缓冲液配制）（5）0.3 mol/L NaOH（6）10mmol/L KH2PO4（7）3m mol/L NaF2、器材：（1）恒温水浴槽（2）可见光分光光度计（3）试管、刻度吸管[方法和步骤]取 20 支试管按下表编号1~5 号为各不相同底物浓度的样品的空白管各空白管在加入 NPP 和缓冲液后，先加 NaOH，后加酶液其余各按下表操作以 1~5 管中相应的底物浓度作空白，在可见光分光光度计上测O.D405表一：试管号试剂（mL）1.2 mmol/L NPP10mmol/L KH2PO43m mol/L NaF0.05mol/L 柠檬酸缓冲液10.2--1.820.4--1.63空白0.6--1.40.8--1.21.0--1.00.2--1.80.4--1.645678无抑制剂0.6--1.40.8--1.21.0--1.091035℃保温 2min稀释酶液0.3 mol/L NaOH表二：管号试剂（mL）1.2 mmol/L NPP10mmol/L KH2PO43m mol/L NaF0.05mol/L 柠檬酸缓冲液稀释酶液0.3 mol/L NaOH10.20.3-1.520.40.3-1.33KH2PO40.60.3-1.10.80.3-0.91.00.3-0.70.2-0.31.50.4-0.31.345678NaF0.6-0.31.10.8-0.30.91.0-0.30.79101.02.01.02.01.02.01.02.01.02.01.02.01.02.01.02.01.02.01.02.035℃精确反应 15min35℃保温 2min1.02.01.02.01.02.01.02.0[数据处理]通过测定，得到一组数据 O.D405，由于酶反应产物对-硝基盐离子在 0.1-0.2 mol/L NaOH中，在 405nm 出的摩尔消光系数为 18.8×103，则 O.D405与反应速度的换算为：O.D405106测定液体积（mL）v（μmol/L 对-硝基酚/分）=××t18.8×1031000式中，O.D405为每管测定液，t 为反应时间（分） 。

反应液中底物浓度换算式：XMS =3式中，X 为底物加入的 ml 数；3 为反应液体积；M 为加入时底物浓度（mmol/L） 通过计算求得 S， 、v、1/s、1/v、I 等值，然后作双倒数图，三条曲线作在同一曲线上，求出 Km、Vm、Ki 及抑制类型1.02.01.02.01.02.01.02.01.02.01.02.035℃精确反应 15min。