荧光定量PCR仪参数比照表.docx

荧光定量PCR仪参数比照表口 tLdf 品牌QIAGENRocheBio-RadABI比较参数Rotor-Gene Q 5- plex+HRM480CFX96 / IQ5ABI 7300 ( 32000)激发光源LED （发光二极管） 每个通道配备独立的LED光源，HRM为独立的通道氙灯LED / 1个卤素灯卤钨灯：光强逐渐衰 减，寿命短，每2-3个 月需要更换一次独立光源和滤光片独立光源和滤光片， 每个通道均得到特 异，均一的激发；最 小的光谱重叠，6个LED独立激发， 无需预热，使用方 便，即开即用，自动 开关光源，即使过 夜，也不用担心光源 会烧坏棱镜折射，光谱重叠及 相互的干扰，需要预 热，实验结束必须关 机；氙灯使用寿命仅1000-2000小时，一两年必 需更换，氙灯更换成本 更高达几千美金；且它 们的光强会不断衰减， 影响结果稳定性96个光纤检测，移动 检测，稳定性差，需 要预热，实验结束必 须关机；光路需要复杂调校， 仪器搬动后也需要专 业调校棱镜折射，光谱重叠及 相互的干扰，需要预 热，实验结束必须关 机；卤钨灯使用寿命仅 1000-2000 小时，一两 年必需更换，氙灯更换 成本更咼达几千美金； 且它们的光强会不断衰 减，影响结果稳定性激发光范围365-670nm450nm,483nm,523nm,588nm,615nm400-700nm / 450-730nm500-660nm荧光检测器PMT （光电倍增 管）：灵敏度咼CCDCCD /二级管低温CCD :灵敏度 低，检测线性范围较窄升降温速率升温15°C/秒；降温20 °C /秒。

升温 4.8°C/sec 降温 2.5°C/sec升温5C/sec 降温 3.3C/sec基座的平均升降温速度 3.5C/秒，样品实际平 均温度变化速度为1C/ 秒温度均一性±0.01 C±0.2 C±0.5 C±0.5 C温度分辨率±0.02 C± 0.1 C± 0.2 C± 0.25 C线性范围与 区分度10个数量级（1-101（）能清晰区分单个拷贝10个数量级9个数量级9个数量级温度范围室 温-99C4-99 C4-99 C4-99 C反应体系最低可以做5微升体 系，节省试剂5-100ul 体系10-50ul 体系只能做到10微升体系内参温度均一性好，没有 光程差，不需要加ROX内参96孔板有光程差，必 须加ROX内参96孔板有光程差，必 须加ROX内参温度均一性不够好，96 孔板有光程差，必须加 ROX内参，增加了成 本HRM分析技术上专用的HRM分析工 具，可自动分类/型， 突变检测等需要增加软件的功能， 不同的软件，HRM功能表现不 好，无文献支持HRM功能表现不好，无 文献支持耗材耗材开发专用耗材，顶部无法标 记专用耗材，顶部无法 标记专用耗材，顶部无法标 记这个表格反映的是碱基的不同，带来的Tm值的变化，可以看出A/T之间的突变， 需要温度分辨率小于＜ 0.2C才能区分开，而象AB等其它公司的分辨率是土 0.25，所 有它是区别不开第四类的SNP变化的，HRM技术的发明者，曾发表过一篇文章，用市场上所有能做HRM机器的定量，做 了一次比较，结果显示QIAGEN Rotor-Gene Q是能做的最好的一个公司； 文章全文可见以下链接：Herrmann et al 2007 Clinical Chemistry 53, http://www.clinchem ・org/cgi/content/abstract/clinchem ・2007・088120v1 Expanded Instrument Comparison of Amplicon DNA Melting Analysis for Mutation Scanning and GenotypingFig 1 （detail） Normalized melting curves of a 110 bp B -globin amplicon （triplicate HRM data）以下是一些关于定量 PCR HRM（High Resolution Melt 中文：高分辨率熔解曲线）一些介绍！（QIAGEN）有2个最显著特点：1）是温控精度非常高（温度均一性：±0.01 r，温度分辨率：±o.o2°C ）及升降温速度非常快（升温可达15 c/秒，降温可达20c/秒）2）是区别与其它的公司定量PCR的是它的HRM功能，这个是其 它厂家都无法能做到的（比如ABI 7500Fast及其它公司这种板式加热系统， 因为它的温度分辨率达不到） QIAGEN 是一个集遗传分析和定量完美结合 的一款机器 ;现阶段，大家检测SNP时都用一贯的检测方法，包括测序，探针还有 DHPLC等等，而甲基化大多用MSP.至于HRM技术并不为大家所熟知，有 两个原因:1）适合做HRM技术的仪器在国内的普及程度不高，具我了解能真正能够做HRM 的只有 QIAGEN Roter-Gene Q+HRM 系列和 Idaho LightScanncer.Roche；其中QIAGEN在其温度控制及软件分析上是做的 最好的.（其它的比如ABI 7500 Fast及伯乐也对外宣传它的HRM功能，但由 于它的温控精度，决定了它做HRM功能是做不好的，可见也是一个赶时髦的功 能，也只能通过软件的模拟来处理）2）HRM的实验灵敏度太高，影响实验因素过多，很多人都做了，但是就是做 不出来•因此就放弃，就换用其他比较成熟的方法•殊不知,HRM技术的检测 方法有其他技术难以比拟的优势，不仅能实现高通量和高精度的同 时,PCR和荧光定量在同一管内进行，能够有效避免假阳性.（QIAGEN在上海 有个用的非常好的用户，是交通大学华山医院的 关明 主任 ，用这个机器发表 了一篇非常好的文章，如果老师有兴趣，可过去看看）作为新一代的遗传扫描工具,HRM具有"简，效抉，廉"等其他技术难以比拟 的优势:简: 无需序列特异性探针,不受碱基位点局限,同时检出已知或未知突变、 SNP 和甲基化位点：闭管操作，避免交叉污染。

效：最低检测0.1%-0, 01%的突变或异常甲基化，检测SNP灵敏度和特 异性均为 100%快： 1 次同时检测几十个样本，在一个小时左右就完了成检测廉：简化操作步骤、降低人工和试剂成本，费用远少于测序、Taqman探 针等方法价格就几毛钱（2 毛人民币）；其它用定量PCR来做SNP研究的方法，都只能对已知SNP进行分 析，而且基本都需要合成序列特异性探针，局限性和费用都比较大，一来 只能做已知的SNP，二来需要合成序列特异性探针而HRM则不受这 些条件的限制，既可做已知位点又可做未知位点，且无需序列特异性探 针，费用大大降低，应用的灵活性也大大提高HRM技术特别适用于样本量多、检测位点较少的SNP、突变或甲基化 分析，是不同于基因芯片检测方法（检测位点多，样本少）的高通量方 法同时，也是基因芯片筛选后的多个基因在更多标本中验证的最佳方法之前市场上定量PCR，都是没有HRM功能的，都是普通的定量，而 HRM技术的应用却是在2007年时才兴起的。