动物染色体工程课件.ppt

第七章第七章 动物染色体工程动物染色体工程（Chromosome Engineering）动物染色体工程第七章 动物染色体工程（Chromosome Engine7 动物染色体工程§染色体工程：按设计、有计划地消减、添加或代换同种与异种染色体以及染色体内部部分遗传操作的技术§可用于：遗传等基础研究、多倍体育种、人工诱导雌雄核发育、性别控制等动物染色体工程7 动物染色体工程染色体工程：按设计、有计划地消减、添加或7.1 人工诱导多倍体人工诱导多倍体§多倍体：？植物多、动物少§多倍体的优点：生长快、成活率高、抗病能力强、经济效益高等§如美洲角蛙（4n）、银鲫（天然3n）§20世纪30年代以来，陆续人工诱导成功多倍体动物现今已成为低等经济动物育种的主要技术，且社会和经济效益明显动物染色体工程7.1 人工诱导多倍体多倍体：？植物多、动物少动物染色体7.1.1 人工诱导多倍体动物的方法人工诱导多倍体动物的方法§原理：§染色体加倍——多倍体；§3n——抑制受精卵第二极体放出；§4n ——抑制第一次卵裂§（受精？极体？卵子？卵裂？）动物染色体工程7.1.1 人工诱导多倍体动物的方法原理：动物染色体工程7.1.1 人工诱导多倍体动物的方法人工诱导多倍体动物的方法§1、生物学方法：杂交（特别是种间杂交，第二极体不排出）产生异源多倍体。

§雌草鱼（2n=48）× 雄三角鲂——3n杂种（3n=72）；§异育银鲫与兴国红鲤杂种——受精卵融合——复合四倍体动物染色体工程7.1.1 人工诱导多倍体动物的方法1、生物学方法：杂交（7.1.1 人工诱导多倍体动物的方法人工诱导多倍体动物的方法§2、物理学方法：温度休克、水静压、高盐高碱§（1）温度休克法：略高、低于致死温度（冷0~5℃，热30 ℃ ）处理——阻止第二极体排除（或第二次减分）——3n或4n.§廉价、易操作§冷水性鱼：热休克；温水性鱼：冷休克动物染色体工程7.1.1 人工诱导多倍体动物的方法2、物理学方法：温度休7.1.1 人工诱导多倍体动物的方法人工诱导多倍体动物的方法§（2）水静压法：§65㎏/㎝2，3~5min，抑制第二极体排出或第一次卵裂§优点：成功率高（95~100%）、处理时间短、受精卵损伤小、成活率高§缺点：设备成本高动物染色体工程7.1.1 人工诱导多倍体动物的方法（2）水静压法：动物染7.1.1 人工诱导多倍体动物的方法人工诱导多倍体动物的方法§3、化学方法：§细胞松弛素B、秋水仙素类——4n；§麻醉剂（N2O、CHClF2、PEG）——3n。

§缺点：化学品价贵、有毒性、发育成没价值的嵌合体、推广难动物染色体工程7.1.1 人工诱导多倍体动物的方法3、化学方法：动物染色7.1.2 多倍体倍性鉴定多倍体倍性鉴定§各处理后：有多倍体、二倍体、嵌合体§直接和间接鉴定染色体倍性§1、核体积测量：多倍体核大于二倍体核如鱼类红细胞核2n : 3n : 4n = 1 : 1.5 : 1.74§2、蛋白质电泳：有差异，但要慎用§3、生化分析：如关东银鲫的3n：红细胞少、大，血红蛋白高，丙酮酸激酶高§染色体计数：直接但费时动物染色体工程7.1.2 多倍体倍性鉴定各处理后：有多倍体、二倍体、嵌合7.1.2 多倍体倍性鉴定多倍体倍性鉴定§5、DNA含量测定：流式细胞仪——测定单细胞DNA含量、显微光密度测定DNA——组织切片动物染色体工程7.1.2 多倍体倍性鉴定5、DNA含量测定：流式细胞仪—7.1.3 多倍体动物的应用多倍体动物的应用§1、生活和生长能力：§低等动物种间杂种生长快，但成活率低§人工诱导的3n种间杂种多数成活率高，生长快§2、性腺发育与应用：§3n不育，能耗下降，避免繁殖、肉质下降、上市延迟，价格好，生长不停滞、不死亡、养殖成本下降，经济效益高。

4n与2n杂交获3n）§3、其他经济形状：多倍体肉质美、耐低氧、抗病强、对光和声感觉迟钝动物染色体工程7.1.3 多倍体动物的应用1、生活和生长能力：动物染色体7.2 人工诱导雌、雄核发育人工诱导雌、雄核发育§7.2.1 人工诱导雌核发育（gynogenesis）：§雌核发育：核失活或消失的精子与正常卵子受精，胚胎发育仅由母体基因（卵子）控制个体发育现象可自然发生和人工诱导§1、精子遗传物质的失活：§（1）辐射： r射线（60Co、173Cs、） X射线：穿通力强、处理大体积的精子；染色体断裂；精子存活有影响；少量精子染色体片段可能有作用动物染色体工程7.2 人工诱导雌、雄核发育7.2.1 人工诱导雌核发育（7.2.1 人工诱导雌核发育§紫外线：穿透力低，但安全；胸腺嘧啶二聚化，可见光下可修补复活，处理效果不很好§（2）化学物质：§甲苯胺蓝、乙烯尿素、二甲基硫酸等§（3）显微手术：除去受精卵的雄原核动物染色体工程7.2.1 人工诱导雌核发育紫外线：穿透力低，但安全；胸腺嘧7.2.1 人工诱导雌核发育§2、二倍体化：§（1）温度和压力：第二极体、卵裂§（2）化学制剂：？§3、雌核发育的意义：§（1）产生单性种群：同型雌配子的品种：全为雌性（XX）后代；异型雌配子的品种（x或y）：后代为雌性（xx）或雄性（yy）。

§（2）同源型二倍体克隆：§选择育种；基础生物学研究动物染色体工程7.2.1 人工诱导雌核发育2、二倍体化：动物染色体工程7.2.2 人工诱导雄核发育人工诱导雄核发育§雄核发育（androgenesis）：？§二倍体雄核生殖的个体生存率很低：精子基因的纯合性、卵子的损伤、阻止第一次卵裂的损伤§意义：遗传学基础理论、育种应用、核质杂种、性别控制（yy雄性）动物染色体工程7.2.2 人工诱导雄核发育雄核发育（androgenes7.3 动物的性别控制动物的性别控制§意义：畜牧业、家禽、水产、蚕丝等§畜牧业：母畜经济价值高奶牛、奶羊、母鸡等；雄性肉牛、绵羊、猪生长快，肉质美，价值高动物染色体工程7.3 动物的性别控制意义：畜牧业、家禽、水产、蚕丝等动7.3.1 动物的性别决定动物的性别决定§1、遗传决定§雄性异配子型： XO、XY§雌性异配子型：ZO（昆虫）、ZW（鸟）§雌性单倍性型：孤雌生殖（1n）——雄体，受精（2n）——雌体膜翅目：蜜蜂、马蜂、蚂蚁§2、环境决定：无性染色体，雌雄同体分化出两种性器官位置、内环境决定§外环竟决定：蛙：雌体为xx，雄体为xy蝌蚪在20℃时，雌雄各半；30 ℃时全为雄体。

动物染色体工程7.3.1 动物的性别决定1、遗传决定动物染色体工程7.3.2 动物性别控制的途径与方法动物性别控制的途径与方法§1、分离X、Y精子：直接、经济§（1）X、Y精子的差异：X精子的 DNA含量多；X精子的头部较大；X精子重密度大； X精子膜负电荷较多；Y精子速度快；Y精子上有特异DNA§（2）精子分离：都不很成熟离心法；免疫法（Y精子有H-Y抗原）；流式细胞分类器（DNA含量）动物染色体工程7.3.2 动物性别控制的途径与方法1、分离X、Y精子：直7.3.2 动物性别控制的途径与方法动物性别控制的途径与方法§2、鉴定胚胎性别：§核型分析（100%准）§生化微量分析（X、Y相连的酶活力）§免疫学方法（H-Y抗原与其单抗）§分子生物学方法（Y染色体的特异标记的DNA序列探针与胚胎细胞DNA杂交）动物染色体工程7.3.2 动物性别控制的途径与方法2、鉴定胚胎性别：动物7.3 动物性别控制的途径与方法动物性别控制的途径与方法§3、控制发育条件：§（1）温度：§鳄鱼（无性染色体）：30℃时全为雌体；32℃时有雌雄体；34 ℃以上全为雄体§（2）性激素：§如鱼类，甲基睾丸酮使（遗传）雌体发育为雄体；雌二醇使（遗传）雄体发育为雌体。

动物染色体工程7.3 动物性别控制的途径与方法3、控制发育条件：动物染色7.3 动物性别控制的途径与方法动物性别控制的途径与方法§4、受精条件：§（1）pH§动物阴道pH 影响X、Y精子的移动速度pH偏酸时， Y精子的速度慢，X精子的速度快先达卵子而受精如用凝胶pH剂人为改变动物阴道pH,可控制性别§（2）激素§在精液中加入生物组织（睾丸、胎盘、脑垂体）制剂或激素，控制性别§5、性反转法：性激素；性激素+交配技术筛选（性反转的假雄性（XX ）与雌体交配——全为雌鱼）§6、雌、雄核发育动物染色体工程7.3 动物性别控制的途径与方法4、受精条件：动物染色体工7.4 动物染色体结构的改造动物染色体结构的改造§7.4.1 染色体片段的删除和重组§使动物携带特定染色体区片段的缺失突变，利于系统的基因定位和功能分析§1、放射线诱导染色体缺失突变：§放射线处理ES细胞，使染色体产生缺失、易位、倒位、复制与基因内的点突变，再植入囊胚内，产生带突变的个体，进行功能的研究已成为功能基因组学的研究热点§2、Cre 2 loxP介导染色体重组： Cre 2 loxP（源于cause recombination,重组酶）介导两个loxP间（的序列删除）重组，导致染色体倒位、删除、易位，实现染色体的定点操作。

动物染色体工程7.4 动物染色体结构的改造7.4.1 染色体片段的删除和7.4.2 染色体的易位染色体的易位§1、雄性（ZZ）家蚕出丝率高于雌蚕(ZW)20%§2、辐射诱导发生第10号染色体向W染色体易位，产生两个易位品系：一个片段有基因w2,另一个有基因 w3w2、 w3为隐性基因，纯合体的卵为（淡）杏黄褐色，同时存在时为黑卵§3、两个品系互交：黑雄卵、杏（淡）黄卵雌卵光电选卵机选雌卵孵化，降低成本动物染色体工程7.4.2 染色体的易位1、雄性（ZZ）家蚕出丝率高于雌蚕(7.5 人工染色体人工染色体§染色体的三个关键（基本）序列：自主复制序列（ARS）——复制起点——确保自我复制；端粒序列（TEL）——端粒——结束复制、确保独立和稳定性；着丝粒序列（CEN）——确保平均分配§人造微小染色体（artificial minichromosome ）：染色体的三个关键序列拼接而成的小染色体广泛应用于大片段DNA分子的克隆、基因组分析、基因功能鉴定、基因治疗、染色体结构与功能关系等方面§如酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）、哺乳动物人工染色体动物染色体工程7.5 人工染色体染色体的三个关键（基本）序列：自主复制序列7.5.1 酵母人工染色体酵母人工染色体§1983年首次构建 YAC (含染色体三要素和外源DNA，55kb)；§1987年构建并证明载体YAC：能克隆大片段人体DNA分子，可用于构建高等生物的完整基因组文库，载体容量提高10倍，达105~1010bp。

§在人类基因组计划研究中发挥了重要作用动物染色体工程7.5.1 酵母人工染色体1983年首次构建 YAC (含7.5.1 酵母人工染色体酵母人工染色体§1、大片段DNA的获取：提取染色体DNA、酶切、电泳、切割回收电泳条带§2、YAC重组体的构建：提取YAC质粒、酶解、获取YAC载体左右臂（带选择标记）、与大片段DNA连接——YAC重组体§3、YAC重组体对酵母的转化：§4、 YAC基因库的鉴定：探针杂交、Southern转移§5、目的基因YAC克隆的筛选鉴定：PCR§6、目的基因YAC克隆的鉴定：探针——目的基因某段序列动物染色体工程7.5.1 酵母人工染色体1、大片段DNA的获取：提取染色7.5.2 细菌人工染色体 §BAC载体：环状质粒§YAC（容量最大的）载体的缺点：插入的片段大，稳定性差；易缺失，文库不稳定；易重排，造成序列错误；文库中嵌合严重（两个、两个以上染色体的DNA），影响基因的分离和分析；难以从酵母中分离§BAC克服了YAC的缺点，广泛用于300bp以下的 DNA克隆动物染色体工程7.5.2 细菌人工染色体 BAC载体：环状质粒动物染色7.5.3 人工染色体的应用人工染色体的应用§1、物理图谱和定位克隆§2、基因功能鉴定和转基因研究§3、染色体结构与功能关系研究§4、基因治疗 动物染色体工程7.5.3 人工染色体的应用1、物理图谱和定位克隆动物染色体7.6 结语结语§1、多倍体动物§2、动物雌雄核发育§3、动物性别控制§4、人工染色体动物染色体工程7.6 结语1、多倍体动物动物染色体工程。