溶酶体cathepsin B参与大黄素诱导HK2细胞凋亡.doc

1溶酶体 cathepsin B 参与大黄素诱导 HK2 细胞凋亡作者：王翠芬，陈敏，吴旭东，孙立新，严明，张陆勇【摘要 】 目的：研究大黄素对人肾小管上皮 HK 2 细胞的细胞毒性及其机制方法：用 MTT 法检测经 0～100 μmol·L-1 浓度大黄素作用后 HK 2 细胞的活力，透射电镜观察细胞核形态的改变，流式细胞仪检测亚二倍体细胞比例，用特异性的底物分别测定caspase 3 和 cathepsin B 的活性结果：大黄素可引起 HK 2 细胞死亡，并伴有亚二倍体细胞比例的增加和核浓缩、染色体边集等形态的改变，在引起 HK 2 细胞凋亡的浓度下 caspase 3 活性增加，而用 caspase 3 特异性抑制剂 Ac DEVD CHO 可抑制上述改变在诱导 HK 2 细胞凋亡的剂量下大黄素使 cathepsin B 表达及其活性升高，cathepsin B 特异性抑制剂 CA 074 能拮抗大黄素诱导的caspase 3 活性升高, 恢复 HK 2 的细胞活力结论：大黄素在体外主要以 caspase 3 依赖方式引起 HK 2 细胞凋亡，cathepsin B 参与了此过程。

【关键词】 大黄素; HK 2 细胞; 凋亡; caspase 3; cathepsin B2大黄素（emodin）为蒽醌类化合物，具有导泻、调节免疫、抗菌抗炎、抗病毒、抗肿瘤等作用1996 年 Marchant 报道大黄素具有肾毒性；2001 年美国 NTP 报道，大黄素可引起实验动物（大鼠和小鼠）肾小管细胞玻璃样变、色素沉着，增加雌性小鼠肾病发生率我们以往的实验也证实中药大黄对肾脏有损害，并已有初步证据表明，大黄素作为大黄的主要生物活性成分之一起着主要作用，但其损害机制还不清楚本实验首先在体外观察大黄素对来源于人肾小管上皮细胞的 HK 2 细胞的直接作用，并探讨大黄素引起HK 2 凋亡的主要途径和可能机制1 材料和方法1.1 细胞培养及相关试剂HK 2 细胞购自 ATCC,置于含 10%胎牛血清的DF12(DMEM∶F12=1∶1)培养基中，在 37 ℃、5%CO2 孵育箱中培养大黄素购自江苏省药品检验所caspase 3 的显色底物Ac DEVD pNA、caspase 3 特异性抑制剂Ac DEVD CHO、cathepsin B 的荧光底物Z Arg Arg 7 amido 4 methyl coumarin hydrochloride、特异性抑制剂 CA 074［N (1 3 trans propyl carbam oyloxirane 2 carbonyl) 1 isoleucyl 1 proline］均购自3Sigma。

抗人 cathepsin B 抗体及二抗均购自 Upstate Biotechnology1.2 MTT 法测定细胞活力取对数生长期 HK 2 细胞,以 5×104 终浓度接种于 96 孔培养板,加入不同浓度(0～100 μmol·L－1) 大黄素,作用一定时间后每孔加入20 μl MTT，再孵育 4 h在酶标仪 570 nm 波长处读取吸光度(A)值每样本重复 3 个孔 ,每个实验重复 3 次 ,取平均值1.3 透射电镜观察细胞核的形态改变分别用不同浓度大黄素处理细胞后，固定，脱水，包埋，最后制成超薄切片，在透射电镜(JEM 2000)下观察并照相1.4 流式细胞仪检测PI 单染：细胞经大黄素处理后分别收集(106 ml－1)，用预冰冷的 PBS 洗 2 遍，在-20 ℃用 70%的乙醇固定至少 1 h，弃去固定液后再洗 2 遍，0.5 ml PI 染液染色，4 ℃避光 10 min，上流式细胞仪检测，分析亚二倍体细胞比例4Annexin Ⅴ/PI 双染：HK 2 细胞经不同处理后收集(106 ml－1)，与 Annexin Ⅴ/PI 试剂避光孵育 30 min，上流式细胞仪检测，分析早期和晚期凋亡细胞比例。

1.5 caspase 3 活性测定收集处理过的细胞 1×106，PBS 洗涤，制备细胞裂解液加 Ac DEVD pNA（caspase 3 四肽显色底物） ，37 ℃反应 2 h用酶标仪 405 nm 波长处读取 A 值1.6 Western blotting细胞经不同浓度大黄素处理后，加入适量细胞裂解液裂解细胞，收集于 1.5 ml 的离心管中，以 12 000 r·min-1 4 ℃ 离心 20 min取上清，用 Bradford 法测定蛋白含量，每种样品各取蛋白50 μg 上样，SDS PAGE 电泳，电转移至醋酸纤维膜上，BSA 封闭，依次滴加一抗（1∶1 000）及二抗（1∶3 000） ，室温下孵育后洗膜显像1.7 cathepsin B 活性测定收集处理过的细胞 1×106，PBS 洗涤，制备细胞裂解液加5cathepsin B 的荧光底物 37 ℃反应 15 min,多功能酶标仪读取荧光值1.8 统计学处理采用 SPSS 10.0 统计软件分析常规进行方差齐性检验、正态性检验,计量资料以 x-±s 表示单变量两组资料之间的比较采用 t检验, 多组资料之间的比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有显著性。

2 结 果2.1 大黄素诱导 HK 2 细胞产生凋亡MTT 结果显示，40 μmol·L－1 大黄素可明显抑制 HK 2 细胞的活力（图 1A） 正常 HK 2 细胞核呈均一着色，经 40 μmol·L－1大黄素处理 24 h 后的 HK 2 细胞细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染（图 1B） 用 PI 单染细胞 DNA，观察基因组 DNA 的变化，发现用大黄素处理的 HK 2 细胞亚二倍体细胞比例增加（图1C） 核浓缩、染色体边集、亚二倍体细胞比例增加是细胞发生凋亡时特有的表现这些结果表明，在本实验剂量和时间范围内大黄素对 HK 2 细胞毒作用主要是通过诱导细胞凋亡而产生的62.2 大黄素依赖 caspase 3 诱导 HK 2 细胞产生凋亡用不同浓度大黄素与 HK 2 细胞分别作用 24 h 后，再用caspase 3 特异性底物 Ac DEVD pNA 测定大黄素对 HK 2 细胞caspase 3 蛋白酶的活性结果（图 2A）表明，大黄素使 HK 2 细胞的 caspase 3 活性浓度依赖性升高用 caspase 3 特异性抑制剂Ac DEVD CHO 200 μmol·L－1 ，2 h 后再加大黄素 40 μmol·L－1 作用 24 h，结果显示细胞活力恢复（图 2B） ，大黄素诱导的亚二倍体细胞比例下降（图 2C） 。

上述结果提示大黄素主要依赖于 caspase 3 诱导 HK 2 细胞产生凋亡 A.大黄素激活了caspase 3 酶活性，且具有浓度依赖性（与对照比较,*P＜0.05,**P ＜0.01） ；2.3 溶酶体途径参与大黄素诱导的 HK 2 细胞凋亡用不同浓度大黄素处理 HK 2 细胞 24 h 后，再采用 Western blot 分析 cathepsin B 的蛋白表达水平，40 μmol·L－1 大黄素使HK 2 细胞 cathepsin B 表达明显升高（图 3A） 用 cathepsin B的特异性荧光底物检测大黄素对 cathepsin B 活性的影响，显示大黄素显著提高了 cathepsin B 的活性（图 3B） 用 cathepsin B 特异性抑制剂 CA 074 和大黄素共处理 HK 2 细胞，结果发现大黄素7诱导的 caspase 3 活性明显被抑制（图 3C）,同时细胞活力也部分恢复（图 3D） 这些结果表明大黄素增加了 HK 2 细胞 cathepsin B 的表达及其活性，大黄素所诱导的 HK 2 细胞凋亡与 cathepsin B 有关3 讨 论大黄 (radix rhizoma rhei)为常用中药，具有泻下、抗菌、抗肿瘤、抗高血脂症等作用［1 2 ］ 。

大黄素的化学名称是 3 甲基1,3,8 三羟基蒽醌，是大黄总蒽醌中的一个主要成分［3 4 ］ 动物亚急性毒性实验和长期毒性实验结果显示，大黄素可导致大鼠肾小管出现病理性改变我们以人肾小管上皮细胞 HK 2 为对象，研究大黄素对其的直接毒性作用及可能的机制本实验首次检测了大黄素对 HK 2 细胞的毒性作用，结果表明大黄素在该实验条件下可抑制 HK 2 细胞生长，出现核浓缩、染色体边集现象，同时亚二倍体细胞比例升高，caspase 3 及溶酶体 cathepsin B 活性增强A.大黄素诱导 cathepsin B 表达升高； B.大黄素诱导 cathepsin B 活性增强（与对照比较，*P＜0.05,**P ＜0.01） ； 凋亡（apoptosis ）是一种伴有染色体浓缩、凋亡小体出现等特征性改变的细胞死亡［5］ 机体内外环境的改变以及各种病理刺激因素均可诱导细胞凋亡细胞在凋亡过程中，DNA 被裂解成小的片段，用流式细胞仪分析细胞 DNA 出现 SubG1 峰即凋亡峰［6］ ，镜下出现核浓缩、核碎8裂、核边集等现象本实验结果充分说明，在实验剂量下大黄素可诱导 HK 2 细胞凋亡caspase 家族是一大类凋亡调节蛋白酶，其中 caspase 3 是介导细胞凋亡的关键效应酶，是凋亡执行的重要效应分子。

在正常情况下，caspase 3 以无活性的酶原形式存在于哺乳动物的组织和细胞内不同的蛋白酶切割 caspase 3 酶原，激活 caspase 3，活化的caspase 3 进一步又切割不同的底物，导致蛋白酶的级联切割放大，最终使细胞走向死亡本实验结果表明，大黄素使 HK 2 细胞的caspase 3 活性增强，进一步说明大黄素可诱导 HK 2 细胞产生凋亡用 caspase 3 特异性抑制剂 Ac DEVD CHO 预处理，则可拮抗大黄素引起的 HK 2 细胞凋亡，此结果提示大黄素诱导的 HK 2细胞凋亡依赖于 caspase 3 途径目前研究发现，在生理和病理情况下引起凋亡的途径有坏死受体途径、线粒体途径等几种［7］ cathepsin B 属于木瓜蛋白酶家族中的半胱氨酸蛋白水解酶，广泛分布于各种组织细胞的溶酶体中，主要降解各种组织蛋白新近研究发现，cathepsin B 不但参与细胞内物质降解，还与细胞凋亡有关cathepsin B 通过裂解 Bid，引起线粒体释放细胞色素 C，从而导致细胞凋亡的瀑布效应［8 9 ］ 在正常状态下 cathepsin B 以酶原形式储存于溶酶体中，相对分子质量 38，一旦释放至胞浆，可被溶酶体中其他蛋白水解酶水解或自9身激活形成相对分子质量 27 的活性形式。

本实验结果发现，大黄素使 cathepsin B 活性形式增多、cathepsin B 活性增强，提示cathepsin B 可能与大黄素诱导的 HK 2 细胞凋亡有关用cathepsin B 特异性抑制剂 AC 047 抑制 cathepsin B 的活性，结果发现大黄素介导的 caspase 3 的活化被拮抗，细胞活力恢复，提示 cathepsin B 参与了大黄素诱导的 HK 2 细胞凋亡，但其通过何种信号通路所介导，有待进一步研究参考文献】［ 1］YU C X，ZHANG X Q，KANG L D，et al.Emodin induces apoptosis in human prostate cancer cell LNCaP［J］.Asian J Androl，2008，10(4):625 634.［2］DONG H，LU F E，GAO Z Q，et al.Effects of emodin on treating murine nonalcoholic fatty liver induced by high caloric laborator。