实验一 蛋白质的沉淀与凝固.doc

1Ⅱ实验内容实验一 蛋白质的沉淀与凝固蛋白质溶液是一稳定的亲水性溶胶液，其稳定的因素有二：一是蛋白质胶粒上的电荷使之相互排斥，不易凝集成团；二是胶粒表面的水化膜，它使胶粒与水融洽相依，又在胶粒之间起了隔离作用如果上述两种稳定蛋白质溶液的因素被破坏，蛋白质将于溶液中沉淀析出促使蛋白质沉淀的因素很多，大致可分为两类：第一类是可逆的沉淀反应这时蛋白质的空间构象未受到很大改变，除去沉淀因素后，可以重新溶解，例如盐析和低温乙醇沉淀蛋白第二类是不可逆的沉淀反应，重金属盐类或生物碱试剂沉淀蛋白后，由于蛋白质结构发生重大改变，所以不再溶于水中不可逆的蛋白质沉淀多表示蛋白质已经变性变性的蛋白质在等电点附近加热时，蛋白质分子间相互盘绕而变成坚实的凝块一、 蛋白质的盐析[原理]高浓度的盐离子可与蛋白质胶粒争夺水化膜，同时盐又是强电解质，可抑制蛋白质的解离因而用高浓度的中性盐，使蛋白质带电量减少，水化膜破坏而从溶液中沉淀出来盐析沉淀蛋白一般不引起蛋白变性，故常用于分离各种天然蛋白质由于蛋白质的组成及性质不同，所以盐析时所需中性盐的浓度也不相同例如半饱和的硫酸铵沉出球蛋白，饱和的硫酸铵则沉出清蛋白[操作]1.取一试管，加入 3ml 5%蛋白质溶液及 3ml 饱和硫酸铵溶液，摇匀静止数分钟后观察现象。

2.将试管内容物过滤，加硫酸铵粉末于滤液中，使达饱和状态，摇匀后观察现象注意固体硫酸铵若加到过饱和则有结晶析出，勿与蛋白质沉淀混淆 ）3.取上项浑浊液 1ml，加水 2ml，观察是否复容二. 乙醇沉淀蛋白质[原理]乙醇是脱水剂，可与蛋白质争夺水化膜；此外，加入乙醇可使水的介电常数变小，蛋白质解离度降低，带电量减少故加入乙醇能破坏蛋白质的胶体性质而使蛋白质沉2淀用此法在低温下操作可使沉出的蛋白质保持其理化特性及其生物学活性，但室温中乙醇与蛋白质接触较久后，可使之变性，形成不可逆的沉淀[操作]1. 取试管 4 支，标出 1、2、3、4 号码，按下表操作试剂 1 2 3 45%蛋白质溶液（ml） 1 1 1 -1%乙酸（滴） - 1-2 - -95%乙醇（ml） - - - 22.将 3 管及 4 管置冰水中，放置 5 分钟，然后将第 4 管的冰乙醇倒入第 3 管中（此步最好在冰水中进行） ，混匀，同时向第 1 及第 2 管中各加入未冰浴的乙醇 2ml 混匀，观察各管的沉淀情况并立即向第 1、2 及 3 管中各加入蒸馏水 10ml，混匀，比较各管变化并解释之三. 重金属盐沉淀蛋白[原理] 在溶液的 PH 值大于蛋白质的等电点时，带负电荷的蛋白质与重金属离子（Ca 2+、Hg 2+、Ag 1+、Pb 2+等）结合成盐而沉淀。

[操作]取试管 4 支，按下表操作试剂 （滴） 1 2 3 45%蛋白质溶液 5 5 5 51%乙酸 - - 10 1010g/L 硫酸铜 3 - 3 -30g/L 硝酸银 - 3 - 3混合均匀，比较各管浑浊程度并解释之四. 生物碱试剂沉淀蛋白[原理]能沉淀生物碱（或植物碱）或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等在溶液的 PH 值小于蛋白质的等电点时，带正电荷的蛋白质与生物碱试剂的负离子结合成盐而沉淀3[操作]取试管 3 支，按下表操作试 剂 1 2 35%蛋白质溶液（ml） 1 1 11%乙酸（滴） 10 10 10苦味酸溶液（滴） 数滴 - -鞣酸溶液（滴） - 数滴 -三氯乙酸溶液（滴） - - 数滴混合均匀，比较各管浑浊程度并解释之五. 蛋白质的加热凝固[原理]蛋白质在其等电点附近加热，即发生变性凝固，在加热过程中，随着蛋白质变性作用的深化，使已变性的蛋白质分子间凝聚成凝胶状的蛋白块但应注意，当蛋白质溶液远离等电点而带有很多同种电荷时，加热虽可使其变性，但因同种电荷的排斥作用并不发生凝固现象[操作]取试管 4 支，按下表操作试 剂 1 2 3 45%蛋白质溶液（ml） 2 2 2 21%乙酸（滴） - 1-2 - -10%乙酸（ml） - - 0.5 -100g/LNaOH（ml） - - - 0.5混匀后各管分别加热，观察有否沉淀析出及沉淀析出的多少、快慢并解释之。

另外在第 2 管加热蛋白沉出后再加入 5ml 蒸馏水，观察是否复溶，为什麽？[试剂]1．5%蛋白溶液：取出鸡蛋清用蒸馏水稀释 5 倍，搅匀后用纱布过滤2．饱和硫酸铵溶液3．硫酸铵结晶粉末4．95%乙醇5．1%乙酸和 10%乙酸46．30g/L 硝酸银溶液7．10g/L 硫酸铜溶液8．100g/L 氢氧化钠溶液9．苦味酸饱和溶液及鞣酸饱和溶液10．100g/L 三氯乙酸溶液李素婷） 5实验三 微量凯氏定氮法[原理]蛋白质样品与浓硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳和水，而氮转变为氨，氨与硫酸结合生成硫酸铵，再与纳氏试剂显色，与标准液比较，可求其含氮量如测血清蛋白，可将总氮量减去非蛋白氮量，再乘以 6.25 即得蛋白质量[操作]1．取血清或血浆 0.2ml，以 0.9%NaCl 溶液稀释至 10ml（稀释 50 倍）2．取消化管 1 支，加入稀释血清 0.5ml，50%硫酸 0.5ml, 玻璃珠 1 枚，在电炉上消化。

3．当出现白雾并充满消化管时，消化管口加玻盖，再继续消化 3 分钟左右，冷却，加 3%H2O21~2 滴，再消化至出现白雾，加盖，继续消化至无色透明，完全冷却后加蒸馏水至 17.5ml，再加纳氏试剂至 25ml，混匀，与标准管比色4．标准管制备：取硫酸铵标准液（应用液）制备标准曲线，以蒸馏水作空白调零，500nm 波长比色5．标准曲线制备：取硫酸铵标准液（应用液）制备标准曲线，取 5 支干净试管操作如下试 剂（ml） 1 2 3 4 5标准硫酸铵应用液 - 0.8 1.2 1.6 2.018N H2SO4 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1蒸馏水 3.4 2.6 2.2 1.8 1.4混匀，各管加奈氏试剂 1.5 ml, 以第 1 管为空白，用 500nm 波长比色得各管光密度值，以浓度为横坐标，测得各管光密度为纵坐标，作一标准曲线6．测得测定管的光密度值，于标准曲线上查出含氮量[计算]蛋白质 g %=含氮量6.25100[试剂]1．50%硫酸2. 18N 硫酸溶液：取比重 1.84 的分析纯浓硫酸 50 毫升慢慢加到 50 毫升蒸馏水中3. 3%H2O24. 0.9%NaCl65. 奈氏试剂：奈氏试剂贮存液：于 500 毫升锥形瓶内加入碘化钾 150 克，碘 110 克及蒸馏水100 毫升和纯汞 150 克，振摇到碘色将变时（约 15 分钟） ，混合液发生高热，将锥型瓶放入冷水内继续振摇至棕红色的碘转变成带绿色的碘化钾汞溶液时为止。

将上清液倾入 2000 毫升的量筒中，用蒸馏水洗涤瓶内壁及瓶内沉淀物数次，将洗液一并倾入量筒中，加蒸馏水至 2000 毫升奈氏试剂应用液：取 10%氢氧化钠溶液 700 毫升，加入奈氏贮存液 150 毫升，摇匀，用蒸馏水稀释到 1000 毫升如浑浊，可静止过夜，取上请液备用6．硫酸胺标准贮存液：（1 毫升=1 毫克氮）取分析纯硫酸铵置烤箱中 110oC，干燥半小时，取出置干燥器内待其冷却，准确称取干燥的硫酸铵 4.716 克，置 1000 毫升量瓶中，加蒸馏水 300 毫升使之溶解，加纯浓硫酸 1 毫升，再加蒸馏水至刻度NH 4)2SO4分子量 132.06；其氮占 28故：132.06﹕28=4.716﹕XX=1即 4.716 克硫酸铵中含氮 1 克7．硫酸铵标准应用液：取硫酸铵标准贮存液 1.0 毫升，于 100 毫升容量瓶中，加纯硫酸 0.1 毫升，以蒸馏水稀释至刻度，于带磨口玻璃瓶中保存周晓慧）7实验四 双缩尿法测定蛋白质含量[原理]凡含有两个以上肽键的化合物在碱性溶液中能与硫酸铜作用生成紫色或紫红色的复合物，这一反应称为双缩尿反应蛋白质含有肽键，因而一切蛋白质均可与双缩尿试剂发生颜色反应，且颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，经与同样处理的标准蛋白溶液相比，即可求出样品中的蛋白质含量。

[操作] 1.标准曲线的制备取 6 支试管按下表配成不同浓度的标准蛋白液试 剂 1 2 3 4 5 6标准蛋白溶液（10mg/ml） 0.0 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9生理盐水（ml） 1.0 0.9 0.7 0.5 0.3 0.1双缩脲试剂(ml) 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0蛋白浓度(mg/ml) 0.0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8混匀后，于 37℃水浴中保温 15 分钟，在 520nm 波长下比色，以第一管调零，测得各管的光密度以各管的光密度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线2.样品测定取待测蛋白样品 0.1ml，加生理盐水 0.9ml，再加双缩脲试剂 4.0ml，于 37℃水浴中保温 15 分钟，测其光密度，查标准曲线即可得出样品中的蛋白质含量[试剂]1．10g/L 标准蛋白溶液：准确称取经凯式定氮法校正的结晶牛血清蛋白或人血清蛋白 10g，用生理盐水配成浓度为 10mg /ml2．双缩尿试剂：称取 CuSO4•5H2O 2.5g、蒸馏水 100ml 加热助溶另取酒石酸钾钠 10g、碘化钾 5g，溶于 500 毫升蒸馏水中，再加 200 g/L NaOH 300ml 混合，然后将硫酸铜溶液倾入，加蒸馏水至 1000 ml。

3.生理盐水（周晓慧）8实验五 改良酚试剂法测定蛋白质含量[原理]蛋白质中所含酪氨酸和色氨酸等残基能在碱性条件下与酚试剂之磷钼酸、磷钨酸作用产生蓝色化合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比利用蓝色深浅与蛋白质浓度成正比的关系可绘制标准曲线，测定样品中蛋白质含量[操作]（一）制作标准曲线1．取试管 6 支分别编号，按下表加入试剂：试 剂（ml） 1 2 3 4 5 6标准蛋白溶液（1mg/ml） 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0生理盐水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0试剂 A 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9混匀后置于 50C 水浴 10 分钟，冷却后各管加入试剂 B 0.1ml，室温放置 10 分钟，各管加入试剂 C 3ml，立即混匀，置 37C 水浴箱恒温 10 分钟冷却后以 1 号管为空白，在分光光度计上以波长 650nm 比色，读取光密度值2.以各标准样品蛋白质浓度为横坐标，各管光密度值为纵坐标作标准曲线二）样品测定取试管 2 支，按下表加入试剂试 剂（ml） 测定管 空白管稀释的待测样品 1.0 -生理盐水 - 1.0试剂 A 0.9 0.9混匀后在 50C 水浴箱中保温 10 分钟，取出冷却后，两管各加试剂 B 0.1ml，室温放置 10 分钟，再各加试剂 C 3ml，立即混匀，置 37C 水浴箱保温 10 分钟，冷却后在分光光度计上以波长 650nm 比色读取光密度值。

[结果与计算]根据测定管光密度值查标准曲线，由标准曲线计算样品蛋白质含量[注意事项]1.测定蛋白质的浓度应在 0.015～0.110mg/ml 范围2.各管加酚试剂必须快速，并立即摇匀，不应出现混浊9[试剂]1.标准蛋白溶液：称量干燥的人血清白蛋白（BSA）或丙种球蛋白 10mg，用生理盐水配制成 1mg/ml 的标准蛋白溶液2．试剂 A：2g 酒石酸钾钠及 100g Na2CO3溶于 500ml 1mol/L NaOH 中，用蒸馏水稀至 1000ml3．试剂 B：2g 酒石酸钾钠及 1g CuSO45H2O 分别溶解于少量水中，混合后加蒸。