KJ201706 动物食品 瘦肉精胶体金.pdf

动物源性食品中瘦肉精胶体金免疫层析法 （KJ201706） 1 范围 本方法规定了动物肌肉组织中克伦特罗、莱克多巴胺及沙丁胺醇的胶体金免疫层析快速检测 方法 本方法适用于猪肉、牛肉等动物肌肉组织中克伦特罗、莱克多巴胺及沙丁胺醇的快速测定 2 原理 本方法采用竞争抑制免疫层析原理样品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇与胶体金标记 的特异性抗体结合，抑制抗体和检测卡中检测线（T 线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深 浅的变化通过检测线与控制线（C 线）颜色深浅比较，对样品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁 胺醇进行定性判定 3 试剂与材料 除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的二级水 3.1 试剂 3.1.1 甲醇：色谱纯 3.1.2 氢氧化钠 3.1.3 磷酸二氢钾 3.1.4 磷酸氢二钠 3.1.5 盐酸 3.1.6 氯化钠 3.1.7 氯化钾 3.1.8 三氮化钠 3.1.9 乙二胺四乙酸二钠 3.1.10 三羟甲基氨基甲烷，即 Tris 3.1.11 乙酸乙酯 3.1.12 磷酸二氢钠 3.1.13 氢氧化钠溶液（1mol/L） ：称取氢氧化钠（3.1.2）4g，用水溶解并稀释至 100mL。

3.1.14 缓冲液：准确称取磷酸二氢钾（3.1.3）0.3g，磷酸氢二钠（3.1.4）1.5g，溶于约 800mL 水 中，充分混匀后用盐酸（3.1.5）或氢氧化钠溶液（3.1.13）调节 pH 至 7.4，用水稀释至 1000mL， 混匀4℃保存，有效期三个月 3.1.15 展开液：准确称取磷酸二氢钾（3.1.3）2g，磷酸氢二钠（3.1.4）1.44g，氯化钠（3.1.6）8g， 氯化钾（3.1.7）0.2g，三氮化钠（3.1.8）0.5g，乙二胺四乙酸二钠（3.1.9）1.0g 溶于约 500mL 水中，充分混匀后用水稀释至 1000mL 3.1.16Tris 缓冲液（pH9.0，1mol/L） ：称取 Tris（3.1.10）121.14g，溶于约 700mL 水中，充分混匀 后加入盐酸（3.1.5）调试 pH 至 9.0 后用水定容至 1000mL 3.1.17Tris 缓冲液（pH9.0，10mmol/L） ：精密量取 1mol/LTris 缓冲液（3.1.16）1mL，用水稀释定 容至 100mL 3.1.18 磷酸二氢钠溶液 （0.2mol/L） ： 称取磷酸二氢钠 （3.1.12） 24.0g， 用水溶解并稀释至 1000mL。

3.1.19 磷酸氢二钠溶液（0.2mol/L） ：称取磷酸氢二钠（3.1.4）28.4g，用水溶解并稀释至 1000mL 3.1.20 磷酸盐缓冲液（pH7.4，0.2mol/L） ：量取磷酸二氢钠溶液（3.1.18）19mL，加入 81mL 磷酸 氢二钠溶液（3.1.19） ，混匀 3.1.21 磷酸盐缓冲液（pH7.4，10mmol/L） ：精密量取 0.2mol/L 磷酸盐缓冲液（3.1.20）50mL，用 水稀释至 1000mL 3.2 参考物质 克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇参考物质的中文名称、英文名称、CAS 登录号、分子式、 相对分子量见表 1，纯度≥97% 表 1 克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇参考物质的中文名称、英文名称、 CAS 登录号、分子式、相对分子质量 序号 中文名称 英文名称 CAS 登录号 分子式 相对分子质量 1 克伦特罗 Clenbuterol 37148-27-9 C12H18Cl2N2O 277.19 2 莱克多巴胺 Ractopamine 97825-25-7 C18H23NO3 301.38 3 沙丁胺醇 Salbutamol 18559-94-9 C13H21NO3 239.31 注：或等同可溯源物质。

3.3 标准溶液配制 3.3.1 标准储备液： 精密称取适量克伦特罗、 莱克多巴胺、 沙丁胺醇参考物质 （3.2） ， 分别置于 100mL 容量瓶中，用甲醇（3.1.1）溶解并稀释至刻度，摇匀，分别制成浓度为 100μg/mL 的克伦特罗、 莱克多巴胺、沙丁胺醇标准储备液18℃保存，有效期一年 3.3.2 克伦特罗标准中间液（1μg/mL） ：精密量取克伦特罗标准储备液（100μg/mL） （3.3.1）1mL 置于 100mL 容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为 1μg/mL 的克伦特罗标准 中间液临用新制 3.3.3 克伦特罗标准工作液（20ng/mL） ：精密量取克伦特罗标准中间液（1μg/mL） （3.3.2）1mL， 置于 50mL 容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为 20ng/mL 的克伦特罗标准 工作液临用新制 3.3.4 莱克多巴胺标准中间液（1μg/mL） ：精密量取莱克多巴胺标准储备液（100μg/mL） （3.3.1） 1mL 置于 100mL 容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为 1μg/mL 的莱克多巴 胺标准中间液。

临用新制 3.3.5 莱克多巴胺标准工作液 （20ng/mL） ： 精密量取莱克多巴胺标准中间液 （1μg/mL）（3.3.4） 1mL， 置于 50mL 容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为 20ng/mL 的莱克多巴胺标 准工作液临用新制 3.3.6 沙丁胺醇胺标准中间液（1μg/mL） ：精密量取沙丁胺醇标准储备液（100μg/mL） （3.3.1）1mL置于 100mL 容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为 1μg/mL 的沙丁胺醇标准 中间液临用新制 3.3.7 沙丁胺醇标准工作液（20ng/mL） ：精密量取沙丁胺醇标准中间液（1μg/mL） （3.3.6）1mL， 置于 50mL 容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为 20ng/mL 的沙丁胺醇标准 工作液临用新制 3.4 材料 3.4.1 克伦特罗试剂盒/检测卡（条） ：含胶体金试纸条及配套的试剂 3.4.2 莱克多巴胺试剂盒/检测卡（条） ：含胶体金试纸条及配套的试剂 3.4.3 沙丁胺醇试剂盒/检测卡（条） ：含胶体金试纸条及配套的试剂 3.4.4 固相萃取柱：丙烯酸系弱酸性阳离子交换柱。

4 仪器和设备 4.1 电子天平：感量为 0.01g 和 0.0001g 4.2 组织粉碎机 4.3 水浴箱 4.4 离心机：转速≥4000r/min 4.5 移液器：10µL，100µL，1mL，5mL 4.6 读数仪：产品配套可使用的检测仪器（可选） 4.7 固相萃取装置（可选） 4.8 其他产品说明书操作中需用的仪器 4.9 环境条件：温度 10—40℃，湿度≤80% 5 分析步骤 5.1 试样制备 取适量具有代表性样品的可食部分，充分粉碎混匀 5.2 试样提取和净化 称取适量试样，按照方法一（5.2.1）或方法二（5.2.2）提取步骤分别对空白试样、加标质控 样品、待测样进行处理 5.2.1 方法一（隔水煮法） 称取粉碎混匀的样品 5g（精确至 0.01g）于 50mL 离心管，置 90℃水浴中加热 20min 至离心 管中可清晰看见有组织液渗透，4000r/min 离心 10min，将上清液转至另一离心管，重复离心操作 一次准确量取上清液 900μL，加入缓冲液（3.1.14）100μL 混匀，即得待测液本方法推荐水浴 加热，也可按照试剂盒说明书进行操作 5.2.2 方法二（固相萃取法） 称取粉碎混匀的样品 5g （精确至 0.01g） 于 50mL 离心管， 加入 10mmol/LTris 缓冲液 （3.1.17）5mL，剧烈振摇 5min，放置 20min，加入乙酸乙酯（3.1.11）10mL，剧烈振摇 1min。

以 4000r/min 离心 2min，上清液待净化连接好固相萃取装置（4.7） ，并在固相萃取柱（3.4.4）上方连接 30mL 注射器针筒，将上述上清液全部倒入 30mL 针筒中，用手缓慢推压注射器活塞，控制液体流速约 1 滴/秒，使注射器中液体全部流过固相萃取柱，尽可能将固相萃取柱中溶液去除干净将固相萃 取柱下方的接液管更换为洁净的离心管，向固相萃取柱中加入 0.5mL10mmol/L 磷酸盐缓冲液 （3.1.21） 用手缓慢推压注射器活塞，控制液体流速约 1 滴/秒，使固相萃取柱中的液体全部流至 离心管中，即得待测液 注：试样制备过程可按照试剂盒说明书进行操作，不做限定 5.3 测定步骤 5.3.1 检测卡与金标微孔测定步骤 测试前，将未开封的检测卡恢复至室温吸取 100μL 上述待测液于金标微孔中，上下抽吸 5 —10 次直至微孔试剂混合均匀室温温育 5min，将反应液全部加入到检测卡的加样孔中，1min 后加入 1 滴展开液（3.1.15） 检测卡加入样本后 10min 进行结果判定 5.3.2 无金标微孔时，检测卡测定步骤 测试前， 将未开封的检测卡恢复至室温 吸取 100μL 上述待测液直接加入到检测卡加样孔中， 1min 后加入 1 滴展开液（3.1.15） 。

检测卡加入样本后 10min 后进行结果判定 5.3.3 试纸条与金标微孔测定步骤 测试前，将未开封的试纸条恢复至室温吸取 100μL 上述待测液于金标微孔中，上下抽吸 5 —10 次直至微孔试剂混合均匀室温温育 1min，将试纸条样品垫插入到金标微孔中室温温育 4min，从微孔中取出试纸条，去掉试纸条下端样品垫，进行结果判定 注：1.测定步骤建议按照试剂盒说明书进行操作 2.结果判定建议使用读数仪，读数仪的具体使用参照仪器使用说明书 5.4 质控试验 每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验 5.4.1 空白试验 称取空白试样，按照 5.2 和 5.3 步骤与样品同法操作 5.4.2 加标质控试验 称取空白试样5g （精确至0.01g） 置于50mL离心管中， 加入适量克伦特罗标准工作液 （20ng/ml） （3.3.3） ，使克伦特罗浓度为 0.5μg/kg，按照 5.2 和 5.3 步骤与样品同法操作 称取空白试样 5g（精确至 0.01g）置于 50mL 离心管中，加入适量莱克多巴胺标准工作液 （20ng/ml） （3.3.3） ，使莱克多巴胺浓度为 0.5μg/kg，按照 5.2 和 5.3 步骤与样品同法操作。

准确称取空白试样 5g（精确至 0.01g）置于 50mL 离心管中，加入适量沙丁胺醇标准工作液 （20ng/ml） （3.3.3） ，使沙丁胺醇浓度为 0.5μg/kg，按照 5.2 和 5.3 步骤与样品同法操作 6 结果判定要求 6.1 读数仪测定结果 通过仪器对结果进行判读 6.1.1 无效 当质控线（C 线）不显色时，无论检测线（T 线）是否显色，均表示实验结果无效 6.1.2 阳性结果 若检测结果显示“+”（阳性） ，表示试样中含有待测组分且其含量大于等于方法检测限 6.1.3 阴性结果 若检测结果显示“-”（阴性） ，表示试样中不含待测组分或其含量低于方法检测限 6.2 目视判定 通过对比质控线（C 线）和检测线（T 线）的颜色深浅进行结果判定 6.2.1 无效 当质控线（C 线）不显色时，无论检测线（T 线）是否显色，均表示实验结果无效 6.2.2 阳性结果 质控线（C 线）显色，若检测线（T 线）不出现或出现但颜色浅于质控线（C 线） ，表示试样 中含有待测组分且其含量高于方法检测限，判为阳性 6.2.3 阴性结果 质控线（C 线）显色，若检测线（T 线）颜色深于或等于质控线（C 线） ，表示试样中不含待 测组分或其含量低于方法检测限，判为。