《地高辛标记系统》PPT课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,探针的标记,地高辛标记系统,常用标记物分类,放射性同位素标记,非放射性标记,荧光素标记,生物素标记,地高辛标记,地高辛（,DIG,）是灵敏度高、非放射性核酸标记检测体系DIG,检测灵敏度接近同位素而无放射性危险、相比荧光则不需要特殊检测设备，相比生物素则没有样本内源干扰之苦，很适合用于核酸非放标记检测地高辛标记的,dUTP,地高辛标记系统的特点,标记和检测技术安全,标记的探针稳定可以保存一年,杂交液可以反复使用数次,与放射性同位素标记方法相同之处,标记和杂交技术相似,高灵敏度,低背景,可以标记,DNA,、,RNA,或,Oligonucleotides,与放射性同位素标记方法不同之处,无害,安全,产生的废物不需特殊处理,需要分析的时间短,探针稳定,地高辛标记与检测的原理,利用不同的方法将,Digoxigenin-11-dUTP,掺入到新合成的探针,DNA,或,RNA,链中或寡核苷酸的末端,探针与目标,DNA,杂交后，用连接有碱性磷酸酶或其它偶联物的地高辛的抗体检测地高辛标记的探针,根据地高辛抗体连接的偶合物不同，利用荧光检测（,anti-DIG-fluorescein,，,rhodamine),、化学发光检测,(anti-DIG-AP and CSPD or CPD-star),或显色（,anti-DIG-AP and NBT/BCIP or other substrates),的方法将探针杂交的位置显现出来,利用随机引物标记的方法将,Digoxigenin-11-dUTP,掺入到新合成的,DNA,链中。

反应体系中包含六碱基随机引物、,dNTP(,含有碱性条件下不稳定的,Digoxigenin-11-dUTP,，,Klenow,酶及反应所需的,Buffer,随机引物标记,DIG-dUTP:dTTP,的理想比例,1,：,3,20-25bp,可插入一个,DIG-dUTP,随机引物法标记的探针是基于模板的不同区段、不同长度的,DNA,片段,可以探测,DNA,的地高辛标记和检测步骤,探针,DNA,的标记及标记效率测定,DNA,的转移和固定,杂交,免疫测定,洗去膜上探针再次杂交,操作基本要求,工作环境及试剂要干净：,（,1,）试剂要高压灭菌；（,2,）含有,SDS,的试剂要过滤灭菌；（,3,）,TWEEN20,应加到预先灭菌过的试剂中,用具要干净：用之前一定要清洗得非常干净,操作尼龙膜时要小心,（,1,）戴无尘手套；（,2,）用干净的镊子夹取膜的边缘,探针模板,DNA,的要求,质粒,DNA,纯度要高最好用高纯度的质粒,DNA,分离和纯化试剂盒纯化质粒模板或用苯酚,/,氯仿抽提去除残留的蛋白质纯化后的模板用,H,2,O,溶解,用作探针模板的,DNA,应是线型的，大于,100bp,，如果模板,DNA 5kb,则应用,4,碱基的限制性内切酶切割成较小片段（切割后要纯化）,模板的量：,10ng-3,g,，如果要检测复杂基因组中的单拷贝基因，标记模板的最低量要,300ng,（探针浓度：,25ng/ml,杂交液）,如果做基因组,DNA,southern blotting,应将克隆倒载体上的,DNA,酶切后琼脂糖电泳分离或,PCR,扩增，得到的片段都需要用试剂盒纯化,标记步骤,(20,l),将,10ng-1,g,模板,DNA,用无菌去离子水补足至,16,l,。

沸水浴或干浴,98 C 10,分钟，使,DNA,变性成单链并迅速冰浴冷却充分混匀,DiG-high Primer,（,1#,管），并取,4,l,至变性,DNA,管，混匀并离心37 C,温育,1,小时或过夜（最大到不超过,20,小时）停止反应，加,2,l 0.2M EDTA,（,pH 8.0,）或,65 C,加热,10,分钟本次实验标记步骤,(10,l),将,300ng,模板,DNA,用无菌去离子水补足至,8,l,沸水浴或干浴,98 C 10,分钟，使,DNA,变性成单链并迅速冰浴冷却充分混匀,DiG-high Primer,（,1#,管），并取,2,l,至变性,DNA,管，混匀并离心37 C,温育,1,小时或过夜（最大到不超过,20,小时）停止反应，,65 C,加热,10,分钟探针标记效率检测,目的是确定杂交中使用正确的探针量，探针用量太多会引起背景太深，用量太少则无杂交或杂交很弱,（探针浓度：,25ng/ml,杂交液）,检测流程,将地高辛标记好的探针系列稀释，点到一条尼龙膜上，同时用地高辛标记的,control DNA,作对照标准，,120,C,固定,30,分钟；,用地高辛抗体免疫检测，按,BNT/BCIP,显色步骤显色；,比较显色结果，选择带有可以接受的背景的最高探针浓度做正式的杂交。

试剂准备（,1,）,Washing buffer:0.1M Maleic acid,0.15M NaCl;pH 7.5(20);0.3%(v/v)Tween20.15-25 stable.Removal of unbound antibody.,Maleic acid buffer:0.1M Maleic acid,0.15M NaCl;adjust with NaOH(solid)to pH 7.5(20)0 15-25 stable.Dilution of Blocking solution.,Detection buffer:0.1M Tris-HCl,0.1M NaCl,pH 9.5(20).15-25 stable.Ajustment of pH to 9.5.,TE buffer:10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH 8.0.15-25 stable.Stopping color reaction.,试剂准备（,2,）,Blocking solution:,用,Maleic acid buffer 10,稀释试剂,6#,（,10Blocking solution,），成,1,的工作液，即每,9ml Maleic acid buffer,中加入,1ml 10Blocking solution,混匀，现配现用。

封闭膜上非特异性结合位点,Antibody solution(Ab)solution:,将,4#,试剂离心，按,1,：,5000,或,1,：,10000,加入,Blocking solution,，,2-8 C,可放,12,小时每,10ml Blocking solution,加,1ul Ab,抗体即可）,.,与地高辛标记的探针结合Color-substrate solution,（显色液）：从试剂,5#(NBT/BCIP),中取,100ul,到,5ml Detection buffer,，要避光，现配现用显示抗体结合的位点,Dig-High Prime DNA,标记及检测试剂盒理想条件下标记产量,Template DNA,1 h,20 h,10 ng,45 ng,600 ng,30 ng,130 ng,1050 ng,100 ng,270 ng,1500 ng,300 ng,450 ng,2000 ng,1000 ng,850 ng,2300 ng,3000 ng,1350 ng,2650 ng,探针定量,根据上表探针标记的理想产量将标记的探针稀释到,1ng/,l.,例如：起始模板用,1g,，,20,l,体系,1h,后，查前表可知其理想标记量是,850ng,，则探针的理想标记浓度为,850ng/20,l=42.5ng/,l;,则取,1,l,标记产物,+41.5,l H,2,O,混匀后即得到,1ng/,l,探针稀释液,.,将试剂盒提供的,control DNA,稀释到,1ng/,l(,原始浓度是,5ng/,l),Tube,From tube#,DNA(,l),DNA dilution buffer(,l),Dilution,Final concentration,1,Diluted orginal,1ng/,l,2,1,2,198,1:100,10 pg/,l,3,2,15,35,1:3.3,3 pg/,l,4,2,5,45,1:10,1 pg/,l,5,3,5,45,1:10,0.3 pg/,l,6,4,5,45,1:10,0.1 pg/,l,7,5,5,45,1:10,0.03 pg/,l,8,6,5,45,1:10,0.01 pg/,l,9,-,0,50,-,0,步骤,将上述稀释的,2-9,号管的,control DNA,及探针,DNA,各取,1,l,点膜,120C,固定,30,分钟或紫外交链,将膜放入装有,20ml Maleic acid buffer,的塑料器皿中，室温,2,分钟,将膜放入,10ml Blocking solution,中室温温育,30,分钟,将膜放入,10ml Antibody solution,中室温温育,30,分钟,用,10ml Washing buffer,洗,2,次，每次,15,分钟,在,10ml Detection buffer,平衡,2-5,分钟,将膜放入,2ml,新配制的,Color substrate solution,中暗室条件下显色。

显色过程中不要摇动当斑点或带显示出来后，用,50ml,灭菌的双蒸水洗膜,5,分钟，照相,定量结果分析,染色至,0.1pg,的,Control DNA,出现斑点，比较标记的探针与,Control DNA,染色情况计算出地高辛标记的,DNA,的量如果,0.1pg,的探针及对照稀释点都显色，则探针标记理想,如果,0.1pg,的对照显色，,0.1pg,的标记探针没显色，但,0.3pg,显色，则计算探针浓度（约为理想浓度的,1/3,）以确定杂交时加多少探针（,25ng,探针,/ml,杂交液）,如果,0.1pg,的对照显色，但标记探针,0.3pg,的斑点没显色，则应重新标记探针,探针标记效率低的原因及解决办法,1.,标记条件不合适,重新标记，但将标记时间延长至过夜,用相同量的模板标记，但体系放大，体系中的其它成分相应放大,模板放在沸水中变性,2.,模板不纯,只用高纯度模板,用推荐的试剂盒准备模板,纯化模板：用苯酚,/,氯仿抽提后用酒精沉淀,DNA,的转移和固定,固定：,2,的,SSC,短暂洗涤膜后,120C 30 min,或,80C 2h,；或者将膜放在用,10,的,SSC,浸湿的滤纸中,UV-Crosslinkering,不马上使用的尼龙膜放在,2-8 C,干燥保存,预杂交注意事项,预杂交的目的是用非特异性,DNA,分子（鲑精,DNA,）及其它高分子化合物（封闭剂）将待杂交膜中的非特异性位点封闭，从而减少杂交背景。

预杂交及杂交时保证,buffer,覆盖膜,如果尼龙膜要多次探测，务必保证在任何时候都不要让尼龙膜干燥,杂交液组成,5SSC(NaCl,，柠檬酸钠,),50mM PB(NaH2PO4,，,Na2HPO4),5Denhardt(,多聚蔗糖，聚乙烯比咯烷酮，,BSA),2.5mmEDTA,（有,/,无）,100ug/ml SS DNA(,鲑精,DNA),0.1%SDS,10%,硫酸葡聚糖（,dextran sulfate,）,杂交液的准备和杂交温度的计算,DiG Easy Hyb,：将,64ml,无菌去离子水分两部分倒入试剂,7#,瓶（,DiG Easy Hyb Granules),，,37 C,摇动溶解,5,分钟,计算杂交温度：通常为,37 C-42 C,Tm=49.82+0.41(%G+C)-(600/I)(I=length of hybrid in base pairs),Topt.=Tm-20 to 25 C,杂交,预热一定体积的,DiG Easy Hyb,（,10ml/100cm,2,膜）至杂交温度,37-42 C,预杂交,30,分。