NanoDrop蛋白质测定指南.docx

NanoDrop 2000/2000c在蛋白分析中的应用下表是使用了 Thermo Scientific的N anoDrop紫外分光光度计做蛋白质检测中一个非常有用的指南比色分析法如Pierce 660 nm, BCA, Bradford 和Lowr y法，通常用在未知蛋白溶液和溶菌液分析中蛋白质含有色氨酸、酪氨酸残基或半胱氨酸二硫键，这些物质在280nm下有强的紫外吸收, 使用N anoDrop2000/2000c软件A280的蛋白质应用模块，可以建立一个纯蛋白在280nm下比色的快速传统的蛋白质定量方法方法检测下限检出上限方法优点方法缺点方法类型/计算Pierce 660nm50 ug/mL（15:l 试剂/样品体积）25 ug/mL（7.5:l试 剂/样品体积）2000 ug/mL*x* *x* *x* *x* *x* *x* *x* *x* *x* *x*l000 ug/mL快速，简单最正确的全蛋白分 析Compatible withLaemmli loading buffer aswell asmany detergents and reducing agents.储藏和分析室温下进行。

不同蛋白之间测试结果 有所不同，但可作为 Bradford法的一个很好的 不错的补充比色法,线需要标准曲BCA0.2 mg/mL（20:l 试 剂/样品体积）*x* *x* *x* *x* *x* *x* *x* *x* *x*0.0l mg/mL（l:l试 剂/样品体积）8 mg/mL*x* *x* *x* *x* *x* *x* *x* *x* *x* *x*不受大多数表面活性剂影响 （浓度高达5%）.铜螯合剂，还原试剂和高 缓冲能力溶剂可能会影 响BCA分析比色法,线需要标准曲0.2 mg/mL与考马斯亮蓝方法相比，不同蛋白质直接的差异更小Bradford100 ug/mL （50:1试剂/样8000 ug/mL*x* *x* *x* *x* *x* *x* *x* *x* *x* *x*快速简单，室温下操作表面活性剂可能导致试 剂发生沉淀考马斯亮蓝比色法, 线需要标准曲品体积）15 ug/ml（1:1 试剂/样品体 积）100 ug/mL法产生不同蛋白之间数 据差异性是BCA法的两 倍ModifiedLowry0.2 mg/mL4.0 mg/mL可以在650n m到750n m之间 任意波长下测试，而很少有吸 光度强度丢失； 优化的波长测试中采用 750nm，因为很少有其他物质 在该波长下产生吸光清洁剂或钾离子在修饰 Lowr y分析中会形成沉 淀。

清洁剂还原剂和游离 thiols缓冲液同样会影响 分析比色法，需要标准曲 线A2800.10 mg/mL（纯牛血清蛋 白- 基座进样）0.010 mg/mL（纯牛血清蛋 白- 比色皿进样）400 mg/mL（纯牛血清蛋白）快速，不需要额外试剂和预处 理时间，不需要做标准曲线未知蛋白或混合物蛋白 分析中可能会产生相当 大的误差有紫外吸收能力的非蛋 白成分（如核酸、细胞溶 解产物）会影响分析结果吸光度&比尔定律. 非标准曲线蛋白比色法Pierce 660 nm蛋白质分析法标准曲线的线性范围比Bradford法的更宽，不需长的孵化期，试剂常温下贮存在添力口 IDCR试剂（专有离子去垢剂的 相容性试剂）在浓度为50 mM该方法不受常用的清洁剂和还原剂的影响，包括样品含有溴酚蓝的Laemmli样品缓冲液BCA （二喹啉甲酸）蛋白比色法通常用来测较稀的同时存在280nm有较强吸光强度的其它成分的蛋白质溶液由此产生的蛋白-染料螯合物在其最大波长562n m下测其吸光度，并在750n m做标准化Bradford法是根据蛋白能够使考马斯亮蓝改变吸收位移至595nm来检测蛋白浓度的可以从多个厂家购买稳定的混合物考马斯亮蓝染料，其中包含 了考马斯染料，乙醇和表面活性剂套件形式。

响应值随蛋白质的组成不同而有变化该法还对非蛋白来源，特别是清洁剂有响应，并且在高浓度 时出现非线性改性Lowry蛋白分析法是蛋白质与硫酸铜在碱性环境下反应形成铜-蛋白螯合物Folin—酚试剂中的磷钼酸盐一磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯 丙氨酸残基还原，产生水溶性深蓝物，在一定的范围内，蓝色深度与蛋白的量成正比在650nm下检测，405nm处做标准化试验中使用的试剂可 以从多个厂家购买吸光度测试方法NanoDrop™2000/2000c操作系统软件A280模式用于检测纯蛋白质样品的浓度朗伯比尔定律用浓度来（A = E * b * c ）用来关联的吸光度与浓度纯: A是吸光度值（A）,E是与波长相关的摩尔吸光系数（或消光系数），单位为L/ mol-cm）；b 是光程长，以厘米计，c是分析物浓度，用摩尔/升或摩尔浓度（M）来表示该软件提供了六个选项，选择合适的消光系数，与朗伯比尔定律结合在一起，用于计算样品浓度： 一般的理论基础是：0.1%（1 mg/ml） 的蛋白质溶液在280 nm产生1.0的吸光度（当光程是lcm）.夫土 以牛血清蛋白为参考：未知蛋白样品浓度计算用质量消光系数6.7在280nm下1% （10 mg/ml）牛血清蛋 白'igG IgG参考：未知蛋白样品浓度计算用质量消光系数13.7在280nm下1%（10 mg/ml）免疫球蛋白G(10 mg/ml)溶菌酶溶液输入摩尔消光系数值(M-1 cm-1)和分子质量(单位为kDa)作为不同类别蛋白的参考，•可输入的最 大摩尔消光系数值是99999 X 1000， 可输入的最大分子质量输入值为9999 X 1000.输入质量消光系数(L gm-lcm-1)对10 mg/ml (1%)的溶液因为蛋白质的共轭结构，蛋白质与标签法是另一种方法测定纯蛋白浓度(A280nm )和荧光染料浓度。

该方法使用相同6个蛋白样品，选择朗 伯比尔定律来计算样品的蛋白浓度荧光染料浓度也是用朗伯比尔定律和储存在染料/生色列表信息来计算蛋白质与标签法还可以使用不同波长 下吸光度比值来测量金属蛋白纯度(如血红蛋白)。