大肠杆菌感受态细胞的制备和转化.ppt

实验九，十大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 0 在在自自然然条条件件下下, ,很很多多质质粒粒都都可可通通过过细细菌菌接接合合作作用用转转移移到到新新的的宿宿主主内内, ,但但在在人人工工构构建建的的质质粒粒载载体体中中, ,一一般般缺缺乏乏此此种种转转移移所所必必需需的的mobmob基基因因, ,因因此此不不能能自自行行完完成成从从一一个个细细胞胞到到另另一一个个细细胞胞的的接接合合转转移移如如需需将将质质粒粒载载体体转转移移进进受受体体细细菌菌，，需需将将对对数数生生长长期期的的细细菌菌（（受受体体细细胞胞））经经理理化化方方法法处处理理后后，，细细胞胞膜膜的的通通透透性性发发生生暂暂时时性性改改变变，，成成为为能能允允许许外外源源 DNA 分子进入的细胞，称感受态细胞分子进入的细胞，称感受态细胞一一. . 实验原理实验原理1. 概念概念感感 受受 态态 细细 胞胞分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 0      转转化化(Transformation)(Transformation)是是将将外外源源DNADNA分分子子引引入入受受体体细细胞胞, ,使使之之获获得得新新的的遗遗传传性性状状的的一一种种手手段段, ,它它是是微微生生物物遗遗传传、、分分子子遗遗传传、、基基因因工工程程等等研研究究领领域域的基本实验技术。

的基本实验技术 转转  化化分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 0Ø  转转化化过过程程所所用用的的受受体体细细胞胞一一般般是是限限制制修修饰饰系系统统缺缺陷陷的的变变异异株株，，即即不不含含限限制制性性内内切切酶酶和和甲甲基基化化酶酶的的突突变变体体(Rˉ,Mˉ),它它可可以容忍外源以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代分子进入体内并稳定地遗传给后代Ø  受受体体细细胞胞经经过过一一些些特特殊殊方方法法(如如电电击击法法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等等化化学学试试剂剂法法)的的处处理理后后,细细胞胞膜膜的的通通透透性性发发生生了了暂暂时时性性的的改改变变,成成为为能能允允许许外外源源DNA分分子子进进入入的的感感受受态态细细胞胞(Compenent cells)Ø  进进入入受受体体细细胞胞的的DNA分分子子通通过过复复制制,表表达达实实现现遗遗传传信信息息的的转移转移,使受体细胞出现新的遗传性状使受体细胞出现新的遗传性状Ø  将将经经过过转转化化后后的的细细胞胞在在筛筛选选培培养养基基中中培培养养，，即即可可筛筛选选出出转转化子化子(Transformant,即带有异源即带有异源DNA分子的受体细胞分子的受体细胞)。

       转转  化化转化过程转化过程分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 0RbCl(KCl)法，法， CaCl2法，电击感受态制备等法，电击感受态制备等Ø RbCl(KCl)法法制制备备的的感感受受态态细细胞胞转转化化效效率率较较高高，，但制备较复杂，不适合实验室用但制备较复杂，不适合实验室用Ø 电电击击感感受受态态细细胞胞转转化化效效率率高高，，操操作作简简便便，，但但需需电击仪电击仪Ø CaCl2法法简简便便易易行行，，且且其其转转化化效效率率完完全全可可以以满满足足一一般般实实验验的的要要求求，，制制备备出出的的感感受受态态细细胞胞暂暂时时不不用用时时，，可可加加入入占占总总体体积积15％％的的无无菌菌甘甘油油于于-70℃℃以以下下保存半年，因此保存半年，因此CaCl2法使用更为广泛法使用更为广泛.常用的感受态细胞制备方法常用的感受态细胞制备方法分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 0   CaCl2法是以法是以Mendel和和Higa（（1970）的发现为基）的发现为基础，其基本原理是：细胞处于础，其基本原理是：细胞处于 0 ～～ 4 ℃℃，， CaCl2 低低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。

转化混合物渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状转化混合物中的中的 DNA 形成抗形成抗 DNA 酶的羟基酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经附于细胞表面，经 42 ℃℃ 90 秒热激处理，促进细胞秒热激处理，促进细胞吸收吸收 DNA 混合物将细菌放置在非选择性培养基中混合物将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（如氨苄青霉素耐药（ Amp r ）得到表达，然后将此）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含细菌培养物涂在含 Amp 的选择性培养基上，倒置培的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落养过夜，即可获得细菌菌落  CaCl 2 法制备感受态细胞原理法制备感受态细胞原理分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 0提高转化效率的几个因素提高转化效率的几个因素Ø 细胞生长状态和密度细胞生长状态和密度Ø 质粒的质量和浓度质粒的质量和浓度Ø 试剂的质量试剂的质量Ø 防止杂菌和杂防止杂菌和杂DNA的污染的污染分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 0Ø 细胞生长状态和密度细胞生长状态和密度: : 不不要要用用经经过过多多次次转转接接或或储储于于４４℃℃的的培培养养菌菌，，最最好好从从－－70℃70℃或或-20℃-20℃甘甘油油保保存存的的菌菌种种中中直直接接转转接接用用于于制制备备感感受受态态细细胞胞的的菌菌液液。

细细胞胞生生长长密密度度以以刚刚进进入入对对数数生生长长期期时时为为好好，，可可通通过过监监测测培培养养液液的的ODOD600600 来来控控制制DH5αDH5α菌菌株株的的ODOD600600 为为0.50.5时时, ,细细胞胞密密度度在在5 5××10107 7 个个/ml/ml左左右右( (不不同同的的菌菌株株情情况况有有所所不不同同),),这这时时比比较较合合适适密密度度过过高高或或不足均会影响转化效率不足均会影响转化效率 提高转化效率的几个因素提高转化效率的几个因素分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 0Ø 质粒的质量和浓度质粒的质量和浓度: 用用 于于 转转 化化 的的 质质 粒粒 DNA应应 主主 要要 是是 超超 螺螺 旋旋 态态DNA(cccDNA)转转化化效效率率与与外外源源DNA的的浓浓度度在在一一定定范范围围内内成成正正比比,但但当当加加入入的的外外源源DNA的的量量过过多多或或体体积积过过大大时时,转转化化效效率率就就会会降降低低1ng的的cccDNA即即可可使使50μl 的的感感受受态态细细胞胞达达到到饱饱和和一一般般情情况况下下,DNA溶溶液液的体积不应超过感受态细胞体积的的体积不应超过感受态细胞体积的5％。

％提高转化效率的几个因素提高转化效率的几个因素分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 0Ø 试剂的质量试剂的质量: 所所用用的的试试剂剂,如如CaCl2  等等均均需需是是最最高高纯纯度度的的(GR.或或AR.),并用超纯水配制并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处最好分装保存于干燥的冷暗处 Ø 防止杂菌和杂防止杂菌和杂DNA的污染：的污染：整整个个操操作作过过程程均均应应在在无无菌菌条条件件下下进进行行, 所所用用器器皿皿, 如如离离心心管管, tip头头等等最最好好是是新新的的,并并经经高高压压灭灭菌菌处处理理,所所有有的的试试剂剂都都要要灭灭菌菌,且且注注意意防防止止被被其其它它试试剂剂、、DNA酶酶或或杂杂DNA所所污污染染, 否否则则均均会会影影响响转转化化效效率率或或杂杂DNA的的转转入入, 为为以以后后的的筛筛选选、、鉴鉴定定带带来来不不必必要要的的麻麻烦烦 提高转化效率的几个因素提高转化效率的几个因素分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 01）材料）材料　　　　E. coli DH5α菌株；菌株； pBS质粒、 1.5ml 离心管（又称离心管（又称eppendorf管）管） Ampˉ；；       2）设备）设备 　　恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，超　　恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，超净工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度净工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度计，微量移液枪，计，微量移液枪， eppendorf管等。

管等 二二. 材料，设备及试剂材料，设备及试剂分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 0Ø 0.1mol/L的的CaCl2Ø LB液体培养基液体培养基Ø LB固体培养基固体培养基Ø Amp母液：氨苄青霉素母液：氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配母液：配成成 100mg/ml水溶液水溶液, -20℃℃保存备用保存备用 　　　　3.  试试 剂剂分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 0三三. 操作步骤操作步骤         本本实实验验以以E.coli  DH5a菌菌株株为为受受体体细细胞胞,并并用用CaCl2处处理理,使使其其处处于于感感受受态态,然然后后与与质质粒粒共共保保温温,实实现现转转化化由由于于质质粒粒带带有有氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性性基基因因(Ampr )，，可可通通过过Amp抗抗性性来来筛筛选选转转化化子子如如受受体体细细胞胞没没有有转转入入质质粒粒，，则则在在含含Amp的的培培养养基基上上不不能能生生长长能能在在Amp培培养养基基上上生生长长的的受受体体细细胞胞（（转转化化子子））肯肯定定已已导导入入了了质质粒粒。

转转化化子子扩扩增增后后，，可可将将转转化化的的质质粒粒提提取取出出，，进进行行电电泳泳、、酶切等进一步鉴定酶切等进一步鉴定 分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 01.受体菌的培养受体菌的培养 　　　　1) 从从LB平板上挑取新活化的平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落单菌落,接种接种于于3-5ml LB液体培养基中液体培养基中,37℃℃,180rpm振荡培养过夜；振荡培养过夜；            2) 将该菌悬液以将该菌悬液以1:30-100的比例接种于的比例接种于100ml LB液体液体培养基中，培养基中，37℃℃振荡培养振荡培养2－－3小时至小时至OD600在在0.3-0.4左右左右 ;            3) 无无菌菌条条件件下下取取1.5 ml菌菌液液到到eppendorf管管中中，，冰冰浴浴10min，，4℃, 8000rpm离心离心5min;            4)  彻彻底底弃弃上上清清液液，，在在冰冰浴浴上上加加入入500ul预预冷冷的的无无菌菌CaCl2 (0.lmol/L)使细胞悬浮；使细胞悬浮；       分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 0       5) 4℃ ,8000 rpm离离心心4min，，弃弃上上清清液液 (4,5步步可重复可重复1-2次）次）; 6) 用用100μl预预冷冷的的无无菌菌CaC12 (0.lmol/L) 重重新新悬悬浮细胞，冰上备用；浮细胞，冰上备用；注注：：如如果果需需要要保保存存，，用用80ul 预预冷冷的的无无菌菌CaC12 (O.lmol/L)和和20ul无无菌菌的的70%甘甘油油悬悬浮浮细细胞胞，，液液氮氮冷激冷激10min后，后，-70℃以下保存备用。

以下保存备用分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 02. 转化转化①① 取取100μl100μl感受态细胞悬液，在冰浴中使其解冻，感受态细胞悬液，在冰浴中使其解冻，加入加入10μl10μl连接产物（或质粒连接产物（或质粒DNADNA））( (含量不超过含量不超过50ng,50ng,体积不超过体积不超过10μl)10μl)，轻轻摇匀，冰上，轻轻摇匀，冰上30-30-40min40min；；A.A.质粒质粒DNADNA组：组：1010µ µl l pBSpBS质粒质粒DNA +100DNA +100µ µl l感受态细感受态细胞悬液胞悬液B.B.空白对照组空白对照组: :10ul10ul无菌水＋无菌水＋100100µ µl l感受态细胞悬感受态细胞悬液液分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 0②② 42℃℃水浴中热击水浴中热击90秒（勿摇动），热击后秒（勿摇动），热击后迅速置于冰上冷却迅速置于冰上冷却2min；；③③ 向管中加入向管中加入400μL LB液体培养基液体培养基(不含不含Amp)，混匀后，混匀后37℃℃，，180rpm振荡培养振荡培养40min，使，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因抗生素抗性基因(Ampr )；；④④涂平板：将上述菌液摇匀后取涂平板：将上述菌液摇匀后取100ul涂布于含涂布于含Amp的筛选平板上，的筛选平板上，在菌液完全被培养基吸收后，37℃℃倒置培养皿培养倒置培养皿培养12~16h。

 分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 0 注意：注意：1、、含含Amp的的LB固固体体培培养养基基的的配配制制:将将灭灭菌菌的的LB固固体体培培养养基基水水浴浴溶溶解解后后冷冷却却至至60℃℃左左右右,加加入入Amp储存液储存液,使终浓度为使终浓度为50-100ug/ml,摇匀后倒平板；摇匀后倒平板；2、、1 1小时空间：转化后温浴小时空间：转化后温浴45min45min左右，让抗性基左右，让抗性基因得以表达，再涂抗性平板因得以表达，再涂抗性平板   分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 0分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 01.感受态细胞有何特点？如何保证它的质量？2.如阴性对照中长出菌，原因？3.还有哪些方法可以将外源基因导入受体细胞？各有什么优缺点？四四. 问题与讨论问题与讨论。