
细胞生物学-7细胞质基质与细胞内膜-02.ppt
103页第五节 细胞内蛋白质的分选与细胞结构的组装分泌蛋白合成的模型---信号假说蛋白质分选与分选信号膜泡运输 细胞结构体系的组装 一、分泌蛋白合成的模型---信号假说信号序列信号假说(Signal hypothesis) G.Blobel et al:Signal hypothesis,1975信号肽(Signal peptide)与共转移(Cotranslocation)导肽(Leader peptide)与后转移(Post translocation)蛋白质的加工 信号序列(signal sequence)为什么有些核糖体合成蛋白质时不同内质网结合,有些正在合成蛋白质的核糖体要同内质网结合,并将合成的蛋白质插入内质网 设计实验:分别分离mRNA、微粒体和核糖体,然后慢慢 加在一起,进行体外翻译有的mRNA能够与微粒体结 合,而有的mRNA只与核糖体结合合成蛋白质,不能够 与微粒体结合1971年美国洛克菲勒大学的Blobel等提出了信号序 列(signal sequence)的概念①分泌蛋白的N-端含有一段特别的信号序列(signal sequence),可将多肽和核糖体引导到ER膜上;②多肽通过ER膜上的水性通道进入ER的腔中,并推 测多肽是在合成的同时转移的。
• 将RER微粒体置于加有放射性标记氨基酸的 蛋白质合成体系中进行短暂温育,然后加入嘌 呤霉素,使蛋白质合成提前中止并从核糖体 中释放出不完全的多肽此时离心收集RER 小泡,用去垢剂将RER小泡破坏,使小泡内的 物质释放出来,并对其进行分析,结果表明,从 破裂的RER小泡中释放出来的物质中有放射 性标记的新合成的多肽 实验证明膜结合核糖体合成的蛋 白质进入了微粒体的腔 蛋白 质进 入核 糖体 实验信号序列存在的直接证据 1972年, Milstein 和他的同事发现:●从细胞质分离的IgG轻链:多20个氨基酸残基●释放到细胞外的IgG轻链:少20个氨基酸残基推测:这段肽具有信号作用,使IgG得以通过粗面 内质网并继而分泌到细胞外 即信号肽G.Blobel等用离体实验证实了信号肽的存在:●RER对产物的影响●蛋白水解酶实验●多聚核糖体的离体翻译信号肽的证实信号肽的进一步证实 • 因此推测信号序列在引导蛋白进入内质网后被切除 • 蛋白水解酶水解实验 在分泌蛋白进行体外 翻译的无细胞系统中(含有RER小泡)加入蛋 白水解酶,并不能使新生肽水解但同时加 入去垢剂,则能将蛋白质水解,提示新生肽链 是边合成边运输的,因为去垢剂能够破坏内 质网的膜,使合成的蛋白质暴露于蛋白水解 酶遭到降解。
若无去垢剂,多肽在合成的同 时就向内质网转运,所以不受蛋白水解酶的 影响 • 用去垢剂处理从骨髓瘤分离的多聚核糖体,使 之与内质网膜分离后,继续在无细胞体系(不含 RER小泡)中进行翻译,发现:短时间温育,即 可得到成熟的分泌蛋白(无信号序列),而长时间 的温育,得到的产物N-端有信号序列,这一结果 说明由于mRNA中多聚核糖体合成蛋白质的不 同步,位于mRNA3'端的核糖体合成的蛋白质 在分离前不仅进入了内质网,而且在内质网的腔 中被切除了信号序列越靠近mRNA5'端的 核糖体合成的蛋白质越短,所以在体外经较长时 间的翻译得到的是含有信号序列的前蛋白,因为 没有了内质网,信号序列不能被切除 多聚核糖体实验信号肽的特性◆序列特征15-35个氨基酸残基,其中含有4 -12个疏水残基 ◆特异性:不严格 ◆位置: ●N-端突出的一段肽 ●内含信号肽信号假说信号假说内容 指导因子: 蛋白质N-端的信号肽(signal peptide ) 信号识别颗粒(signal recognition particle,SRP )信号识别颗粒的受体(又称停泊蛋白,docking protein,DP)等 早期信号假说内容• (1)分泌蛋白的合成始于细胞质中的游离核 糖体; • (2)合成的N-端信号序列露出核糖体后,靠自 由碰撞与内质网膜接触,然后靠N-端信号序 列的疏水性插入内质网的膜; • (3)蛋白质继续合成,并以袢环形式穿过内质 网的腔;信号序列被信号肽酶切除。
信号肽的一级序列 信号肽一级序列由疏水核心(h)、C端(c)和N端(n)三个区域构成 以血清白蛋白和HIV-1型病毒的糖蛋白gp160信号肽为例,显示出两者的n区长度明显不同 信号识别颗粒(signal recognition partical, SRP)• SRP是一种核糖核酸蛋白复合体,沉降系数为11S,含有分子 量为72kDa、68kDa、54kDa、19kDa、14kDa及9kDa的6 条多肽和一个7S(长约300个核苷酸)的scRNA• SRP上有三个功能部位:信号肽识别结合位点(P54)、翻译暂 停结构域(P9/P14)、SRP受体蛋白结合位点(P68/P72)因 此, SRP能够识别刚从游离核糖体上合成出来的信号肽,并与之结合,暂时中止新生肽的合成,同时与内质网上的停靠 蛋白结合,使核糖体附着到内质网膜上,并进行新生肽的转 移SRP对正在合成的其它蛋白质无作用,这些游离核糖体也就不能附着到内质网膜上信号识别颗粒(SRP)的组成 停靠蛋白 (docking protein, DP)• SRP在内质网膜上的受体蛋白,它能够与结合有信 号序列的SRP牢牢地结合,使正在合成蛋白质的核 糖体停靠到内质网上来。
停靠蛋白含有两个亚基, 一个亚基暴露于细胞质的亲水部分,由640个氨基 酸组成;另一个亚基是嵌入膜内的疏水部分,由 300个氨基酸所组成SRP受体蛋白除了同SRP结 合将核糖体引导到内质网, 同时,它的α亚基与SRP 一起催化GTP水解释放能量,帮助信号肽转位Signal hypothesisSignal hypothesis体外实验证明SRP颗粒、SRP受体的作用修正信号假说• 信号序列与SRP结合SRP上的翻译暂停结构域同核糖 体的A位点作用, 暂时停止核糖体的蛋白质合成 • 核糖体附着到内质网上结合有信号序列的SRP通过它 的第三个结合位点与内质网膜中受体结合, 将核糖体附 着到内质网的蛋白质转运通道 • SRP受体将其结合的GTP水解同时将SRP释放出来,此 时蛋白转运通道打开,核糖体与通道结合,新生的肽插进 通道 • 信号序列与通道中受体结合信号序列与通道中的受体 结合,蛋白质的合成重新开始,并向内质网腔转运 • 信号肽酶切除信号序列 当转运完成之后,若转运多肽 的信号序列是可切割的序列则被内质网膜中信号肽酶所 切割,释放出可溶性的成熟蛋白信号肽与共转移起始转移序列和终止转移序列 起始转移序列和终止转移序列的数目决 定多肽跨膜次数跨膜蛋白的取向 • 起始转移信号:在蛋白质共翻译转运过程中,信号序 列的N-端始终朝向内质网的外侧,插入蛋白质转运通 道后与通道内的信号序列结合位点(受体)结合,其后的 肽序列是以袢环的形式通过运输通道。
不过N-端的起 始转移序列是可切除的序列,它的旁边有信号肽酶的 作用位点,以N-端信号序列作为起始转移信号的一般 都是分泌蛋白内含信号序列:位于N-末端,但具信号序列的作用, 故称为内含信号序列它可作为蛋白质共翻译转移 的信号被SRP识别,同时它也是起始转移信号由于 内含信号序列是不可切除的,又是疏水性,所以它是 膜蛋白的一部分,如果共翻译转运蛋白质中只有一个 内含信号序列,那么合成的蛋白就是单次跨膜蛋白 信号肽与起始跨膜序列内含信号序列与单次跨膜蛋白的整合 停止转移肽(stop-transfer peptide)• 停止转移肽又称停止转运信号(halt transfer signal),它是存在于新生肽中能够使肽链通过 膜转移停止的一段信号序列,结果导致蛋白质锚 定在膜的双脂层, 停止转运信号以α螺旋的形式 锚定在双脂层因停止转移信号的作用而形成 单次跨膜的蛋白,那么该蛋白在结构上只有一个 停止转移信号序列,没有内含转移信号,但在N- 端有一个信号序列作为转移起始信号终止转移信号与单次跨膜蛋白的形成二次与多次跨膜蛋白多个起始与终止跨膜信号重链结合蛋白 (heavy-chain binding protein, Bip)• Bip是一类分子伴侣,属于Hsp70家族,在内质网中有两 个作用。
• 第一,Bip同进入内质网的未折叠蛋白质的疏水氨基酸 结合,防止多肽链不正确地折叠和聚合然后Bip同 ATP结合并通过ATP的水解释放出结合的多肽在多 数情况下,释放出的多肽很快折叠,或者同别的亚基 共同组装成完整的蛋白质正确折叠和装配的蛋白质 不会同Bip再结合,但是,如果蛋白质进行了不正确的 折叠或错误的装配,Bip会马上同这种蛋白结合,使蛋 白质处于未折叠的状态,从而防止了错误的折叠 • Bip的第二个作用是防止新合成的蛋白质在转运过程中 变性或断裂Bip在ER腔中的作用 BiP蛋白在ER中的作用导肽与后转移基本的特征: 蛋白质在细胞质基质中合成以后再转移到这些细胞器中,称后转移(post translocation)蛋白质跨膜转移过程需要ATP使多肽去折叠,还需要一些蛋白质的帮助(如热休克蛋白Hsp70)使其 能够正确地折叠成有功能的蛋白 蛋白质在内质网中的加工与修饰●二硫键●糖基化●羟基化 ●形成脂锚定蛋白 ●蛋白质从内质网的输出二硫键的形成N-糖基化羟基化(hydroxylation)• 除了N-连接糖基化以外,新生肽的脯氨酸 和赖氨酸要进行羟基化,形成羟脯氨酸和 羟赖氨酸,不过这种反应只是在少数蛋白 上发生。
在合成胶原的细胞中,脯氨酸和赖 氨酸羟基化则是一个主要的反应脂锚定蛋白的形成Export of Proteins from the ER二、蛋白质分选(protein sorting)与分选信号(sorting signals) 分选途径 分选信号分选途径(Road map) 核孔运输(gated transport);跨膜运输(transmembrane transport);膜泡运输(vesicular transport)内膜 系统 的蛋 白质 分选蛋白质分选定位的三种途径信号序列的引导作用 ◆与生俱来的三种信号序列●寿命信号●加工信号●定位信号▲核定位信号▲引导肽▲信号肽信号序列 在蛋白质定位中的作用信号没有特异性信号没有特异性• 根据信号序列运输方向的不同分为三种类 型,即入核信号、引导肽和信号肽入核 信号指导核蛋白的运输,引导肽指导线粒 体、叶绿体和过氧化物酶体蛋白的运输, 信号肽则指导内膜系统的蛋白质运输信号序列的类型三.膜泡运输 膜泡运输是蛋白运输的一种特有的方式,普 遍存在于真核细胞中在转运过程中不仅涉及 蛋白本身的修饰、加工和组装,还涉及到多种 不同膜泡定向运输及其复杂的调控过程。
细细胞分泌与内吞作用◆细细胞分泌活动动的过过程●内质质网:●高尔基体:●细细胞质质膜:分泌活动动的类类型◆组组成型分泌途径(Constitutive secretory pathway)◆调节调节 型分泌途径(Regulated secretory pathway)组组成型、调节调节 型分泌途径分泌过过程中的蛋白质质加工 ◆内质质网∶信号肽肽切除; ◆高尔基体∶ ◆分泌泡: 高尔基体蛋白的驻驻留胰岛岛素原的加工胞吐作用(exocytosis)概念:将细细胞内的分泌泡或其它某些膜泡中的 物质质通过细过细 胞质质膜运出细细胞的过过程◆胞吐作用与分泌活动动◆胞吐作用的意义义◆胞吐作用与膜融合胞 吐 作 用膜融合胞吞作用概念:通过细过细 胞膜内陷形成囊泡,将外界物质质裹进进并输输入细细胞的过过程• 吞噬作用(phagocytosis) • ◆巨噬细细胞(macrophage) • ◆中性细细胞(neutrophils) • 胞吞作用(endocytosis) • 吞饮饮作用(pinocytosis) • ◆液相内吞(fluid-p。












