柑桔黄龙病的分子检测技术与应用研究.pdf

柑桔黄龙病的分子检测技术与应用研究木邓晓玲，单振菊，李菁，冯震 ( 华南农业大学植物病理系柑桔黄龙病研究室，广州5 1 0 6 4 2 )柑桔黄龙病( C it r u sH u a n g l o n g b i n g ) 是一种世界性的毁灭性病害，主要发生于东南亚和非洲的4 0 多个国家，严重阻碍了这些国家和地区柑桔产业的生产和发展其病原现在认为是韧皮部杆菌属( L i b e r o b a c t e r ) 的细菌，根据病原物对热的敏感、不同虫媒以及不同的地理分布，分为亚洲种( 三．a s i a t i c u s ) 、非洲种( 三．a f r i c a n u s ) 和美洲( L ．a m e r i c a n u s ) 3 个种，我国及东南亚的柑桔黄龙病病原均属于亚洲种 2 0 世纪6 0 年代初，柑桔黄龙病在我国只分布在广东、广西、福建和台湾4 省，但到8 0 年代已扩展蔓 延到长江流域以南的1 1 个省区，其主要原因之一就是在生产上缺乏一套规范、有效的检测柑桔黄龙病病原的方法，生产和植检部门无法及早地控制带病苗木的传播，使得病害不断扩展蔓延随着我国加入东盟自由贸易区，对农业产业结构进行调整，大力推进了热带、南亚热带大宗优质水果 的区域布局规划，提出优先发展优质柑桔和落叶水果，使得柑桔业的生产得到了很大的发展，在湄公河一带提倡大力发展柑桔生产，而柑桔生产上最严重的病害是柑桔黄龙病，俗称柑桔的“癌症”，因此，对于柑桔黄龙病快速检测则显得非常重要。

为了保证柑桔业的持续生产和发展，建立一套规范、快速、准确的检测柑桔黄龙病病原的技术显得尤 为重要近十年来，随着分子生物学的发展，利用分子生物学新技术检测植物病害的研究越来越受到广泛的重视，其中聚合酶链式反应( P o l y m e r a s eC h a i nR e a c t i o n ，P C R ) 具有快速简便、灵敏度高、特异性强 等优点，成为目前国际上最常用的检测技术1 9 9 3 年V i l l e c h a n o u x 等报道了柑桔黄龙病病原D N A 的部分核苷酸的序列，根据此序列设计P C R 的引物，可以使P C R 技术应用于检测柑桔黄龙病的研究国内外学者在这方面进行大量的研究，但是由于缺乏统一、规范的检测柑桔黄龙病病原的标准，各个实验室所设计的 黄龙病病原的特异引物各不相同，所扩增柑桔黄龙病病原D N A 片段的大小不一，在病原基因组上的位置各有差异，相互之间的结果很难进行比较本研究从目前所报道的5 对引物中筛选出一对最合适的引物A 2 ／J 5 ，利用这对引物对柑桔黄龙病病原 D N A 进行扩增，将扩增产物回收、纯化，并克隆到p M D l 8 一T 载体，筛选得到阳性重组子，对该重组子进行序列分析，结果表明：所克隆片段与柑桔黄龙病病原亚洲种的同源性为9 9 ％，证明已经成功克隆了柑桔黄 龙病病原D N A 片段。

本研究以柑桔黄龙病病原D N A 的阳性克隆重组子为P C R 检测试剂盒的正对照，以A 2 ／J 5 为引物，制备柑桔黄龙病P C R 检测试剂盒，使P C R 检测柑桔黄龙病的新技术能真正在生产中推广应用，为生产和植检部 门提供一套规范、快速、准确、有效的检测柑桔黄龙病病原的方法，对及早地控制带病苗木的传播、有效防治柑桔黄龙病有重要的意义利用该试剂盒对不同地区、不同品种、不同症状类型及未显症状的样品进 行快速、准确、有效的检测1不同地区样品的检测本研究从广东、广西、云南、贵州等地区共采集了1 8 6 个柑桔样品，利用所制备的检测试剂盒进行检测其中广东地区的1 3 4 个柑桔样品，检测到7 1 个为阳性反应；广西地区的2 7 个柑桔样品，检测到1 8个为阳性反应：云南地区的4 个柑桔样品，检测到2 个为阳性反应；贵州地区的2 1 个柑桔样品，检测到 1 3 个为阳性反应，说明该试剂盒适用于不同地区样品的检测2 不同品种样品的检测 本研究对不同柑桔品种的样品进行了收集，利用检测试剂盒进行检测其中在1 0 0 个砂糖桔样品中5 2个为阳性反应；4 个春甜桔样品中2 个为阳性反应：4 个白桔样品中2 个为阳性反应；6 个桠柑样品中3 个 为阳性反应；4 个贡柑样品中3 个为阳性反应；1 个温州蜜柑样品为阳性反应；5 个风彩暗柳橙样品中3 个 为阳性反应；8 个甜橙样品中5 个为阳性反应；5 个红江橙样品中4 个为阳性反应；8 个沙田柚样品中7 个为阳性反应：2 7 个哈母林橙样品中1 8 个为阳性反应；2 个十月桔样品中1 个为阳性反应：2 个蜜桔为阳性 反应。

说明该试剂盒适用于不同品种样品的检测’基金项目：广东省自然科学基金( 0 3 2 2 6 2 ) 和广东省科技攻关项目资助( 2 0 0 4 8 2 0 9 0 1 0 1 0 ) 4 0 53 不同症状样品的检测 柑桔黄龙病的症状比较复杂，容易与一些生理病害相混淆，另外黄龙病还具有隐症带毒现象本研 究将采集的柑桔样品进行了症状分类及试剂盒检测，发现4 1 个斑驳型样品P C R 检测全部都呈阳性反应； 2 3 个黄化型样品中1 3 个表现为阳性；3 0 个缺素型样品中1 6 个表现为阳性；3 个绿岛型样品也都呈阳性；其它5 9 个可疑类型样品中3 0 个表现为阳性因此可见，无论是黄龙病的典型症状，还是某些不明显的可疑症状，利用所制备的试剂盒都能够准确地进行检测4 未显症状样品的检测 黄龙病病原在植株体内的潜育期较长，植株感病后一般不立即表现症状，所以有些看似健康的植株其实已经有黄龙病病原存在本研究采集了柑桔病树周围的未显症状样品，经黄龙病P C R 试剂盒检测后 发现，3 2 个未显症状的柑桔样品，其中也有4 个P C R 检测为阳性5讨论对于不同地区的柑桔样品，检测试剂盒都可以检测到黄龙病病原的存在，说明该检测试剂盒可以应 用于国内黄龙病发生的各地区。

同时，在被检测的所有柑桔样品上都可以检测到黄龙病病原的存在，说明黄龙病病原可以侵染绝大部分的柑桔品种在不同症状类型的样品检测中，我们发现所有斑驳类型的样品在检测时都呈阳性因此，斑驳症状是黄龙病的典型症状，在田间进行病害诊断时，可根据典型的 斑驳症状来诊断黄龙病此外对于未显症状的样品，检测试剂盒同样能够检测到黄龙病病原的存在，说明该检测试剂盒在生产中具有很强的实用性随着我国加入东盟自由贸易区，柑桔产业的发展、柑桔良种苗木繁育体系的形成，无论是在生产上 还是在检疫方面迫切需要一套准确、灵敏、快速的检测方法来检测黄龙病病原P C R 技术虽然已经被证明是一种检测柑桔黄龙病病原的快速、有效的方法但是要在生产上推广应用，使P C R 技术的应用规范 化，必须制备成检测试剂盒，这就要求首先克隆一个柑桔黄龙病病原D N A 的片段，作为P C R 检测的阳性对照，这样才能提高该检测技术的可靠性黄龙病P C R 检测试剂盒的成功研制为生产和植检部门提供了极为有效的检测工具，同时也为及早地控制带病苗木的传播，有效防治黄龙病提供了极为有效的工具4 0 6。